[发明专利]一种快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法，属于生物学领域中分子生物学的检测方法。

背景技术

盐分是限制植物生长和产量的主要环境因素之一，土壤盐渍化是一个世界性问题。植物耐盐新品种的选育，一直是国内外研究的重点。绒毛白蜡(Fraxinus Velutina Torr.)为木犀科(Oleaceae)白蜡属(Fraxinus Linn.)落叶乔木，原产为美国，生长快，树干通直，纹理美观，抗逆，是盐碱地造林、园林绿化和珍贵的用材树种，是唯一的盐碱地造林的大乔木树种。但是，大多数绒毛白蜡不能够在含盐量超过0.3％以上的盐碱地上正常生长和繁殖，其中山东省林业科学研究院刘德玺选育的鲁蜡3号(Fraxinus Velutina Torr.Lula 3)品种，具有非常强的耐盐能力，能够在含盐量0.5-0.6％条件下可以正常生长发育。该品种对沿海城市的绿化和美化、位于盐碱地的油田地区的绿化、盐碱地的土壤改良具有重要作用。

但从形态学鉴定耐盐和盐敏感植株非常困难，尤其是从耐盐和盐敏感植株杂交后代筛选出耐盐个体，通常要进行生理测定和耐盐试验，耗时、费力且许多表型特征的不稳定性，而且可能破坏植株，另外形态特征测量和生理指标测定结果时常出现误差。植物的耐盐性状是受多基因控制的，耐盐植株和盐敏感植株在基因组上存在一定的差异性。以PCR为基础的分子生物学技术是快速检测生物基因组差异的重要方法之一，直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境因素的影响，且取材少，在苗期可以进行选择，从而大大提高育种效率。然而，经检索目前国内外尚无对绒毛白蜡植物耐盐性状分子快速检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的是对已有耐盐品种杂交后代耐盐鉴定方法中存在的费时、费力、成本高、准确性低的缺点，提供一种具有快速、简便、成本低、灵敏度高的鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法。

本发明所述的快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法，步骤是：

(1)应用SEQ ID NO.1所示核酸序列为SCAR标记，以绒毛白蜡植物DNA为模板，利用所述SCAR标记的两条引物在54～56℃的退火温度下，进行PCR扩增，其中：所述SCAR标记的两条引物分别是：

引物1：5’TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3’；

引物2：5’CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3’；

(2)将上述PCR扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观测PCR结果；

(3)鉴定是否为耐盐绒毛白蜡植株；如果PCR结果扩增出一条592bp的DNA条带，判定为耐盐植株；如果PCR结果扩增不出592bp的DNA条带，判定为盐敏感植株。

其中：

步骤(1)所述的PCR反应总体积优选为：25微升，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl(天根生化科技有限公司)，引物1(10μmol/L)1μl，引物2(10μmol/L)1μl，20ng基因组DNA2μl，ddH₂O 8.5μl。

步骤(1)所述的PCR反应参数优选为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃1.5min，循环30次，72℃延伸10min。

本发明采用RAPD技术，寻找与耐盐碱性状相关联的RAPD分子标记，进一步转化为稳定性、重复性强的SCAR标记，该SCAR标记是全长592bp的特异片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。应用所述SCAR标记，以绒毛白蜡植物DNA为模板，采用简单易操作的PCR扩增，即可利用分子标记快速检测绒毛白蜡杂交后代的耐盐植株与盐敏感植株，为利用分子标记辅助选育和基因工程等手段改良绒毛白蜡耐盐新品种提供了基础，加速了绒毛白蜡耐盐育种进程。为我国耐盐碱林木种质的选育研究提供理论基础和技术体系；丰富耐盐碱绿化树种的遗传多样性，扼制土地盐渍化，提高土地生产力；增加生态、社会和经济效益都具有现实而深远的意义。

本发明提供的快速鉴定耐盐绒毛白蜡的分子检测方法，具有灵敏度高，所需DNA用量少的特点，与常规形态学检测、耐盐试验、生理指标测定相比，本发明的有益效果是：

1、简便易行：在实验室采用常规PCR技术对绒毛白蜡植株进行检测，通过一次PCR扩增就可以判断绒毛白蜡是否为耐盐单株或耐盐品种，在植株生长的任何时期都可以检测。