[发明专利]小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合及PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合，同时还涉及一种使用该引物的实时荧光定量PCR方法，属于生物检测技术。 

背景技术

黄嘌呤氧化酶(XO)是体内核酸代谢中一种重要的酶，该酶广泛分布于人体心、肺、肝脏、小肠粘膜等组织细胞浆膜内，血清中的XO主要来自于肝细胞。黄嘌呤氧化酶是一种专一性不高，既能催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，进而生成尿酸，又能直接催化黄嘌呤生成尿酸的酶。底物专性较广，除以嘌呤衍生物为电子供体外，还可以蝶啶衍生物、醛(生成羧酸)为电子供体，表面上生成羟基化合物，氧原子来源于水。电子受体很多，有分子氧、硝酸盐、苯醌、硝基化合物、NAD、铁氧还蛋白等，但依酶的来源而有所不同。在反应时生成过氧化物，引起连锁反应。 

以往的对黄嘌呤氧化酶的研究主要集中在该酶的序列、结构、功能、活性以及其抑制物上，中国专利公报公开了一种申请号为02827205.6的发明专利，公布了一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，而对于黄嘌呤氧化酶转录水平研究上缺乏有效的工具。 

实时荧光定量PCR的基因扩增法已被广泛应用于基因转录水平的定量。实时荧光定量PCR可以对极微量的DNA模板进行准确定量，因其精度高，时间短而被广泛的应用。目前国内外还未见对黄嘌呤氧化酶转录水平定量方法的研究。 

为了研究小鼠体内黄嘌呤氧化酶的转录水平，需要建立一种能够精确对黄嘌呤氧化酶mRNA定量的方法，进而为研究黄嘌呤氧化酶功能及其影响因素打下基础。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合，以在转录水平上对黄嘌呤氧化酶进行定量。 

同时，本发明的目的还在于提供一种使用该PCR引物组合的实时荧光定量PCR方法。 

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合，该核苷酸序列为： 

正向：5’-TATGGCCCCGAGGTAAAAAC-3’ 

反向：5’-GGGCGGCCTGTCTTGTATGC-3”。 

本发明的技术方案还采用了一种小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量实时荧光定量PCR 方法，以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量黄嘌呤氧化酶转录水平。 

所述的扩增序列为： 

tatggccccgaggtaaaaatcgagaaaggagatctcaagaaaggcttttctgaagctgacaatgttgtctcaggaga 

attatatattggtggccaggagcacttctatctggagacccactgcaccattgccgtgccgaaaggcgaggcaggcg 

agatggagctcttcgtgagcacacagaacaccatgaaaacccagagctttattgcaaagatgttgggtgttccagac 

aacagaattgtagtccgagtgaaaagaatgggtggaggctttggagggaaggagacccggagcactctgatatccac 

agcagtggccttggctgcatacaagacaggccgccc 

所述的PCR扩增体系为：25μL体系2×SYBRMix 12.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，cDNA模板2μL，9.35μL去离子水，TaqDNAPolymerase 0.15μL，三步法对样品进行扩增，在荧光定量PCR仪上获取CT值。 

所述的三步法为：95℃3min，95℃30sec，60℃30sec，72℃31sec，40个循环。 

本发明应用实时荧光定量PCR方法对黄嘌呤氧化酶转录水平定量方法进行研究，通过黄嘌呤氧化酶序列设计特异引物，从而建立了快速、高效、准确的定量黄嘌呤氧化酶转录水平的方法。通过分析小鼠黄嘌呤氧化酶基因序列，设计特异引物，能够快速、精确的对黄嘌呤氧化酶转录水平定量。本发明的引物可以通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法来进行的DNA合成技术来获得，引物序列是在充分分析黄嘌呤氧化酶基因序列的基础上，因此对材料中非目的基因没有扩增信号。通过使用本发明的引物，对小鼠的黄嘌呤氧化酶转录水平实施定量，方法简单，精确。并且，分发明的引物特异性强，不会受到其他基因的干扰，为研究小鼠黄嘌呤氧化酶功能以及其他因素对其影响提供了有效工具。