[发明专利]一种从成熟红麻叶片中提取DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种红麻DNA研究技术，更具体地涉及一种高质量、高产量的红麻成熟叶片的DNA提取方法。

背景技术

红麻(Kenaf)是锦葵科(Malvaceae)木槿属（Hibiscus）一年生韧皮纤维作物，公元前4000年的非洲苏丹就已栽培，红麻作为天然纤维作物，具有生长速度快、抗逆性强、适应性广等特点，巨大的生物产量为树林的3-4倍，极强的二氧化碳吸收能力为森林的4-5倍，是发展低碳经济的优势作物。红麻纤维除传统上作为加工麻绳、麻袋、地毯等的原料外，还是加工汽车内饰、板材、麻碳等的良好材料，其纤维经变性可与棉花混纺为面料，具有吸湿、透气、抑菌等生物功能。

随着分子生物学的发展，通过提取植物DNA进行基因库构建、基因克隆、遗传转化、分子标记等已在各种植物的研究中迅速展开。在这些技术的操作过程中，提取高质量DNA样品是必要前提，能够有效提取高质量DNA，一直是广大生物技术工作者关心的问题。棉花、荔枝等植物含有大量的酚类物质及其次生代谢物质，在DNA提取过程中通常会受到这些次生代谢物质的干扰，影响DNA的质量和产量，因此对这类植物进行DNA分离时，其提取缓冲液和分离步骤应有相应的变化（王珍，方宣钧，2003）、（郭安平，黄明等，1997）。

红麻成熟叶片中含有多糖、多酚及其他次生代谢产物，这些次生物质在DNA提取过程中常与核酸形成复合物，形成粘稠的胶状物质，并产生不同程度的褐化，对酶切、PCR扩增等操作产生不良影响，从而不能用于分子生物学研究。而成熟红麻叶片含有较多多糖、多酚及其他次生代谢产物，加大了DNA提取的难度。另外，红麻虽是自花授粉作物，但在繁种生产中常出现自然杂交株，难以保持品种的特性和纯度（何凡，1989）。因此，为确保所提取的红麻DNA纯度，必须根据红麻生长期内纯合的植株叶片为材料，而不是幼苗期的叶片。目前，有关红麻基因组DNA提取方法的报道较少，且均以幼嫩、新鲜叶片为试材（徐建堂等，2007；郭安平等，1997），对成熟、干燥叶片的DNA进行提取的研究虽也有报道（曹德菊，1999；白凤虎，2007），但由于步骤操作复杂，严重影响了红麻DNA的提取效率。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高效、稳定地从成熟红麻叶片中提取DNA的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

称取红麻成熟叶片1.0g，用液氮迅速研磨至粉末状，将粉末装入10ml离心管中，管中加入3ml 65℃预热的重量比为4%CTAB 提取缓冲液，重量比为3%抗氧化剂β-巯基乙醇；然后冷却至室温，加入等体积的氯仿与异戊醇混合液，混合液中氯仿/异戊醇按体积比为24/1，轻柔颠倒混匀10min；1200rpm 离心10min；吸取上清液转入10ml离心管中，依次加入1/3体积的3 mol/L NaAc溶液及等体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀，冰上沉淀30min；于1200rpm 离心10min；将沉淀移入1.5ml离心管中，用75%无水乙醇漂洗3min，重复1次；将沉淀真空抽干或于室温下吹干，加入100μl TE 溶解沉淀，进行DNA纯化或放入-20℃冰箱保存备用。所提取的DNA条带清晰，用于分子标记研究，或红麻叶绿体DNA和线粒体DNA的扩增研究。

本发明的显著优点：

红麻成熟叶片中富含多糖、色素、酚类等次生代谢物质，这些物质极易引起红麻DNA褐化、降解，严重影响了后续的PCR扩增及条带亮度。本发明操作步骤简单，节省了DNA提取时间，在磨样后于提取液中加入了3% β-巯基乙醇，可有效防止红麻样品的色素、酚类和醌类等次生代谢物质的氧化干扰，同时在第一次离心后得到的上清液加入1/3体积的3 mol/L NaAc（pH4.8），有利于变性的红麻DNA凝聚而沉淀，提高了红麻基因组DNA的产量。本发明优化的红麻成熟叶片DNA提取方法重复性好、实验结果较稳定、琼脂糖电泳条带清晰。本发明操作步骤简单，节省了DNA提取时间，从而有效防止DNA氧化而造成的损失，提高DNA的提取产量，本发明为进一步开展红麻及其麻类的基因组学的研究奠定工作基础。

附图说明

图1 两种方法获得的红麻DNA 的1.0%琼脂糖凝胶电泳图；1-8 泳道: SDS法获得的红麻福红952 DNA；9-18泳道CTAB法获得红麻福红952 DNA。