[发明专利]免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法，尤其涉及免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗制备中重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)由Barry J. Marshall和J. Robin Warren于1983年首次发现，是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的革兰氏阴性菌，是慢性活动性胃炎、十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC) 将幽门螺杆菌定为Ⅰ类致癌原。目前全球近50%的人口感染了幽门螺杆菌，在发展中国家其感染率可高达70%以上，严重影响了人类的健康。现有的治疗幽门螺杆菌的手段主要是联合应用抗生素及抑酸剂，但存在耐药性广泛，副反应大，治疗费用高且易复发等缺点。

免疫治疗可能是有效控制幽门螺杆菌的最有效、最有前景的方法之一，幽门螺杆菌疫苗的研制已经成为目前研究的热点。目前已发现尿素酶(UreA和UreB)、空泡毒素(VacA)、热休克蛋白(HspA和HspB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)、细胞毒素相关蛋白(CagA)、黏附素(Adhesin) 等亚单位蛋白或其融合蛋白均可以作为免疫原刺激机体产生保护性免疫反应，其中尿素酶B亚单位(UreB)由于缺乏尿素酶活性却保留了其免疫原性、在幽门螺杆菌中高度保守而被确定为幽门螺杆菌疫苗研究的首选抗原。为了增强幽门螺杆菌蛋白的免疫原性一般将其与粘膜佐剂联合应用，目前幽门螺杆菌疫苗常用免疫佐剂是霍乱毒素(Cholera toxin，CT)和大肠杆菌不耐热毒(Heat-labile enterotoxin，LT)，但都具有明显肠毒性，现在多采用CT的B亚单位(CTB)以及LT的B亚单位(LTB)代替全毒素作为免疫佐剂。

在口服蛋白亚单位疫苗生产中蛋白亚单位抗原的表达量成为制约其成本的关键因素，因此寻找低成本表达抗原蛋白的方法势在必行。目前家蚕生物反应器主要是利用家蚕杆状病毒表达系统实现对外源基因的表达。其优势主要有： 1)表达量高：利用杆状病毒polh基因和p10基因的强启动子驱动外源基因的高效表达；2)可容纳大的外源基因：杆状病毒基因组在大小上差异很大(88~165kbp)，病毒可以容纳较大的外源基因片段而不影响自身正常的复制和包装；3)适合于表达毒性蛋白：由于重组杆状病毒极晚期基因启动子驱动的外源基因的表达是在子代芽殖、有感染力病毒成熟之后进行的，因此，表达具有细胞毒性的蛋白不会影响病毒的复制；4)具转录、翻译后加工：家蚕杆状病毒表达系统具有很强的转录、翻译后加工能力，表达产物在结构、生物活性、免疫原性和糖基化修饰等方面与天然蛋白具有很强的相似性；5)安全性好：昆虫杆状病毒只在无脊椎动物细胞中复制，对脊椎动物和植物细胞而言并非病原体，因此昆虫杆状病毒表达系统对使用者是安全无害的(家蚕杆状病毒的表达宿主有家蚕细胞、家蚕幼虫和蚕蛹，但家蚕幼虫和蚕蛹使用范围较广，因其便于注射操作)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB), 该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus），保藏编号为CGMCC No.5580。

上述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)的制备方法，包括以下步骤：

(1)由PCR扩增的方法获得口服免疫佐剂CTB基因序列与幽门螺杆菌抗原蛋白ureB基因序列，并且在口服免疫佐剂CTB基因与抗原蛋白ureB基因之间加入一段连接肽序列Linker，构建CTB-Linker-ureB融合基因；

(2)步骤(1)所得CTB-Linker-ureB融合基因用BamH I和EcoR I进行双酶切后回收，连接到载体pBacPAK8，使该融合基因置于多角体蛋白基因启动子控制之下，转化TG₁大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，得到重组转移质粒pBacPAK8-(CTB-Linker-ureB)；