[发明专利]免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB), 该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.5580。

2.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)由PCR扩增的方法获得口服免疫佐剂CTB基因序列与幽门螺杆菌抗原蛋白ureB基因序列，并且在口服免疫佐剂CTB基因与抗原蛋白ureB基因之间加入一段连接肽序列Linker，构建CTB-Linker-ureB融合基因；

(2)步骤(1)所得CTB-Linker-ureB融合基因用BamH I和EcoR I进行双酶切后回收，连接到载体pBacPAK8，使该融合基因置于多角体蛋白基因启动子控制之下，转化TG₁大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，得到重组转移质粒pBacPAK8-(CTB-Linker-ureB)；

(3) 取步骤(2)所得的重组转移质粒pBacPAK8-(CTB-Linker-ureB)和线性化的家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染BmN细胞，通过空斑筛选法筛选阳性，即得到所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)。

3.根据权利2所述的方法，其特征在于，步骤1)中利用PCR技术在口服免疫佐剂基因下游连入一段连接肽序列Linker：

AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC，然后利用重叠延伸PCR技术将连有连接肽序列的口服免疫佐剂基因与幽门螺杆菌抗原蛋白基因进行融合。

4.根据权利3所述的方法，其特征在于，所述连接肽序列Linker是编码为(Gly₄Ser)_n的柔性肽段，其中1≤n≤6。

5.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

6.一种权利要求5所述蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；

(2)针刺接种法接入家蚕蚕蛹或幼虫；

(3)收集表达的权利5所述蛋白。

7.一种权利1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-(CTB-Linker-ureB)在免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗制备中的应用。

8.一种权利要求5所述的蛋白在免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗制备中的应用。