[发明专利]分枝杆菌最低抑菌浓度检测系统的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分枝杆菌的药物最低抑菌浓度(MIC)检测或抗菌药物筛选领域，具体涉及一种分枝杆菌的药物最低抑菌浓度(MIC)检测系统的制备方法，所述检测系统适用于分枝杆菌、放线菌、真菌、细胞等药敏检测检测。

背景技术

迄今为止，结核病仍是全球范围内最为常见的感染性疾病之一，尽管全球结核病总发病率已开始下降，但耐药现象日益严重。世界卫生组织(WHO)数据表明2010年世界结核病患者880万，死亡110万。不完善的治疗方案和管理措施已导致结核病耐药率及耐药程度逐渐增加，2010年至少有5％的新发病例或复发病例属于耐多药结核病(MDR-TB)。目前，中国仍是世界第二大结核病负担国，2010年患病人数达90-120万，2008年我国基线调查表明，涂阳肺结核患者中MDR-TB患病率为8.32％，广泛耐药结核病(XDR-TB)为0.68％。

结核病的病原体是抗酸分枝杆菌，主要是结核分枝杆菌复合群，其次为非结核分枝杆菌(NTM)。由于结核分枝杆菌耐药的增加及NTM对一些常见抗结核药物的天然耐受，使分枝杆菌MIC的检测显得尤为重要。分枝杆菌MIC值反应了细菌的耐药程度，其准确而快速的检测对临床事实个体化治疗、药物剂量的优化以及抗结核新药的筛选具有重要作用。

目前可用于结核分枝杆菌MIC值测定的方法按所使用的培养基类型分为两大类：一是基于传统固体培养基的表型检测方法如：琼脂稀释法、纸片琼脂扩散法、Etest法等；二是基于液体培养基中结核分枝杆菌的生长或其代谢反应为基础的检测方法具体有：BACTEC放射性检测系统、分枝杆菌生长指示管MGIT、肉汤常量稀释法、肉汤微量稀释法(BMM)、硝酸还原法(NRA)、阿玛尔蓝(Alamar blue)法、刃天青法、四唑盐法等。由于固体培养基中药敏检测周期较长，药物降解、吸附明显，测定结果偏高，其运用受到一定的限制；而基于液体培养基检测方法中的BACTEC放射性检测系统虽然检测周期较短，但常只检测药物的一个临界浓度，且具有放射性污染。分枝杆菌生长指示管MGIT法解决了放射性污染问题，检测速度快，敏感度和特异性较高，但也仅进行药物一个浓度的检测，而不是MIC检测，此外其成本较高难以在发展中国家广泛运用。肉汤常量稀释法消耗培养基较多，成本较高。肉汤微量稀释法(BMM)，虽然降低了培养基的使用量，但其靠肉眼观察菌量进行判读，容易误读，且灵敏度有限。液体培养中的几种基于氧化还原指示剂的微量显色法检测周期相对较短，其测定结果与血药浓度更有可比性，具有巨大的运用潜能。目前所使用的微量显色法都是先将菌液培养一段时间后，打开培养板盖子，加入显示试剂，再进行短时间的培养显色，这既操作复杂又增加了污染几率，还容易引起生物安全问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测方法的不足，提供一种适用于分枝杆菌药物MIC检测系统的制备方法，具有操作简便、快捷、稳定性好、污染率低可用简单设备或肉眼判读结果的优点。为分枝杆菌药物MIC检测、药物筛选等提供一种简单、快速、廉价的检测系统。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

分枝杆菌最低抑菌浓度检测系统的制备方法，包括以下步骤：将配制好的50-200微升、浓度为0.01-400微克/毫升的含药液体培养基与5-100微升1×10³-1×10⁸个/毫升的分枝杆菌菌液、5-50微升显色剂混合，在30-40摄氏度下恒温共培养3-14天后，进行显色检测，并根据显色检测结果，判定药物最低抑菌浓度，其中在混合后，所述显色剂的终浓度为0.08-10毫摩尔/升。

在本发明的一实施方式中，所述方法还包括将5-50微升的中间电子受体与所述含药液体培养基、分枝杆菌菌液、显色剂混合，其中在混合后，所述中间电子受体的终浓度为10-200微摩尔/升。

在本发明的一实施方式中，所述分枝杆菌主要为结核分枝杆菌复合群，其次为非结核分枝杆菌(NTM)，还可以为放线菌、真菌或细胞。

在本发明的一实施方式中，所述分枝杆菌菌液的制备为采用麦式比浊法或吸光度法获得一定浓度的菌液，按一定倍数进行稀释或不稀释后备用。

在本发明的一实施方式中，所述含药液体培养基的配制是按照倍比稀释法用液体培养基稀释药物。

在本发明的一实施方式中，在适当的培养载体中配制所述含药液体培养基，所述培养载体是不低于2行5列的微孔板、不低于500微升的离心管或不低于5毫升的试管。