[发明专利]一种重组墨吉明对虾溶菌酶及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学制药技术领域，具体的说是利用生物技术制备墨吉明对虾溶菌酶的方法。本发明还涉及该方法制备出来的墨吉明对虾溶菌酶的应用。

技术背景

溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性酶，它能催化细菌细胞壁中粘多糖N-乙酚胞壁酸和N-乙酞葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键的水解，导致细胞裂解，内容物逸出而使细菌死亡，是一种很有效的广谱性抗菌剂。近来的研究发现溶菌酶的杀菌活性并不仅因为其能够溶解细菌的细胞壁，还因为其蛋白内部存在一个或多个双亲性的蛋白螺旋结构域，它们可以刺穿细菌的细胞膜，造成细菌的正常生理代谢发生紊乱直至死亡。溶菌酶蛋白分子经高温变性后，虽然其水解细菌细胞壁能力丧失，但由于位于分子内部的双亲性的蛋白螺旋结构域暴露在外部，其抗菌能力反而更强了。另外，溶菌酶还有保护炎症部位的正常组织作用、提高单核细胞吞噬外来病菌、抑制细菌内毒素释放和抑制真菌和病毒等作用。它广泛存在于自然界动植物和微生物的组织、体液及分泌物中，在生物机体的抗病性及免疫防御系统中发挥重要作用。

溶菌酶作为天然的抗菌剂、免疫增强剂和防腐剂目前广泛应用于医药、食品及饲料等行业。需要特别指出的是，因为人和哺乳动物细胞是没有细胞壁结构的，也不含有肽聚糖成分，故任何来源的溶菌酶对人和哺乳动物均无毒性作用。溶菌酶的应用领域包括以下几个方面：1)溶菌酶可以作为防腐剂。它本身是一种天然蛋白质，能被人体作为C和N源吸收代谢，且对人和哺乳动物无任何毒性，因此是一种安全性非常高的食品防腐剂；2)抗生素替代品。目前滥用抗生素带来的问题也越来越受到人们的关注，一是耐药性问题，二是药物残留问题，其副作用是不可忽视的，目前急需开发一种针对不同耐药菌株均有效的“超级抗生素”用于医学治疗和养殖产业。溶菌酶是一种天然无毒的酶制品，它对人类及大部分水生动物和畜禽动物即是体内自身的免疫因子，增强动物机体的免疫力，又可作为医疗和养殖生产中的杀菌剂，降解和杀死常见的致病菌。所以，该溶菌酶可以代替抗生素应用于临床治疗和养殖生产中。3)在食品、饮料和化妆品中作为添加剂使用。溶菌酶集药理、保健和防腐三个功能于一体，作为一种天然蛋白质无任何毒副作用。例如，食品中若加入溶菌酶，可补充人体内的非特异性免疫因子，增强人体抗感染能力，杀死肠道内的腐败病菌，维持肠道内菌群正常化。若加入到化妆品中，可以治疗由金黄色葡萄球菌、丙酸杆菌和螨虫等引发的痤疮和青春痘的治疗。

溶菌酶大体可分为3种类型：C型、G型和噬菌体溶菌酶，它们在底物种类和杀菌活性方面存在着比较大的差异。迄今所发现的绝大部分的溶菌酶均属C型(如人溶菌酶和鸡蛋清溶菌酶)。目前生产上常用的溶菌酶都是从鸡蛋清中制备的。但高等动物的C型溶菌酶普遍杀菌活性不高，抗菌谱也不够广，不能杀灭革兰氏阴性细菌。

来自低等动物--海洋甲壳类动物中提取的溶菌酶生物化学性质不同于人和鸡蛋白溶菌酶。来自于海洋类甲壳类动物的溶菌酶很少受到温度的影响，有很宽的适应范围。与蛋清溶菌酶相比，它具有嗜低温、抗氧化和杀菌谱广的特点，能特异性地分解革兰氏阳性和阴性菌的细胞壁形成溶菌现象，具有杀菌、防腐、抗病毒等功效，在医药、食品、饲料及化妆品等产业具有独特优势和广阔的市场前景。

目前溶菌酶主要从蛋清中提取，由于来源有限，生产工艺复杂，溶菌酶产量十分有限，价格居高不下，难以满足越来越大的市场需求。因此用基因工程手段表达溶菌酶成为很重要的手段。前期的研究者利用RT-CR和RACE-PCR技术，从墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)机体中克隆得到一种溶菌酶基因(GenBank：EU591712)；并通过生物信息软件分析得到关于其编码产物的结构特点信息(“Molecular cloning，characterization，expression and antibacterial analysis of a lysozyme homologue from Fenneropenaeus merguiensis”，Mol Biol Rep(2009)36：1587-1595，DOI 10.1007/s11033-008-9355-8。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用生物技术制备墨吉明对虾溶菌酶的方法及其应用。