[发明专利]一种重组墨吉明对虾溶菌酶及其制备和应用

权利要求书

1.一种重组墨吉明对虾溶菌酶，其特征在于通过下述方法制备：将墨吉明对虾溶菌酶基因连接到真核表达载体pPIC9K中构建重组质粒，并将所形成的重组质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，经甲醇诱导表达，然后经分子筛层析柱纯化后得到重组溶菌酶。

2.如权利要求1所述的重组溶菌酶，其特征在于具体的制备步骤是：

1）重组fLysC质粒的构建

从新鲜墨吉明对虾中取出墨吉明对虾肠组织，提取总RNA，并通过反转录PCR扩增墨吉明对虾溶菌酶的cDNA，用引物FM-7和FM-8进行PCR扩增；PCR产物纯化后与真核表达载体pPIC9K分别用EcoR1和NotI酶切，回收酶切片段，将这二片段于室温用T4连接酶连接2-8小时，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为重组fLysC质粒；

所述FM-7：5’--GCAGAATTCCCCTCCATCGTGGGCCGTGATTGC--3’

FM-8：5’--AAGTTTTGTAAGGTCACGTCCAGCCAGCTCAT--3’；

2) 溶菌酶的表达与制备

将重组fLysC质粒DNA用Bglll酶解，用电击法将质粒DNA转化至酵母菌 GS115中，并涂布于含有氨苄青霉素LB固体培养基上培养上，筛选转化子即为GS115/fLysC, 将选出的高拷贝转化菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中继续培养，筛选含墨吉明对虾溶菌酶基因的重组酵母菌株；

3）重组墨吉明对虾溶菌酶的浓缩纯化：将重组酵母菌株先在BMGY液体培养基中，30℃摇瓶培养，250转/分钟；当OD值达到8.0士0.5时，更换培养基，用原培养物10%体积的BMMY培养基，继续培养；每24h添加甲醇，保持甲醇浓度0.3% (v/v)，4天后结束培养，离心收集培养液上清；将该培养液上清经过硫酸铵饱和沉淀然后透析去除多余硫酸铵，再经过sephadex-G75分子筛层析柱洗脱，用0.05M pH8.0 Tris-HCI连续洗脱，然后将洗脱液在冻干机上冻干，得到重组溶菌酶干粉。

3.一种重组墨吉明对虾溶菌酶的制备方法，其特征在于该方法是将墨吉明对虾溶菌酶基因连接到真核表达载体pPIC9K中构建重组质粒，并将所形成的重组质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，经甲醇诱导表达，然后经分子筛层析柱纯化后得到重组溶菌酶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）重组fLysC质粒的构建

从新鲜墨吉明对虾中取出墨吉明对虾肠组织，提取总RNA，并通过反转录PCR扩增墨吉明对虾溶菌酶的cDNA，用引物FM-7和FM-8进行PCR扩增；PCR产物纯化后与真核表达载体pPIC9K分别用EcoR1和NotI酶切，回收酶切片段，将这二片段于室温用T4连接酶连接2-8小时，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为重组fLysC质粒；

所述FM-7：5’--GCAGAATTCCCCTCCATCGTGGGCCGTGATTGC--3’

FM-8：5’--AAGTTTTGTAAGGTCACGTCCAGCCAGCTCAT--3’；

2) 溶菌酶的表达与制备

将重组fLysC质粒DNA用Bglll酶解，用电击法将质粒DNA转化至酵母菌 GS115中，并涂布于含有氨苄青霉素LB固体培养基上培养上，筛选转化子即为GS115/fLysC, 将选出的高拷贝转化菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中继续培养，筛选含墨吉明对虾溶菌酶基因的重组酵母菌株；

3）重组墨吉明对虾溶菌酶的浓缩纯化：将重组酵母菌株先在BMGY液体培养基中，30℃摇瓶培养，250转/分钟；当OD值达到8.0士0.5时，更换培养基，用原培养物10%体积的BMMY培养基，继续培养；每24h添加甲醇，保持甲醇浓度0.3% (v/v)，4天后结束培养，离心收集培养液上清；将该培养液上清经过硫酸铵饱和沉淀然后透析去除多余硫酸铵，再经过sephadex-G75分子筛层析柱洗脱，用0.05M pH8.0 Tris-HCI连续洗脱，然后将洗脱液在冻干机上冻干，得到重组溶菌酶干粉。

5.一种权利要求1所述的重组墨吉明对虾溶菌酶作为抑菌剂的应用。

6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于是作为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抑菌剂的应用。

7.按照权利要求5所述的溶菌酶的应用，其特征在于作为金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、痢疾志贺氏菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌的抑菌剂的应用。