[发明专利]一种马链球菌兽疫亚种的酶联免疫检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于流行病学和卫生检测领域。具体而言，本发明涉及一种快速检测马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)的酶联免疫吸附试验(ELISA)快速检测试剂盒，以及使用该试剂盒进行检测的方法。

背景技术

马链球菌兽疫亚种是我国猪链球菌病的主要病原，属于兰氏分群中的C群链球菌，该菌主要引起马、猪、牛、犬、猫等多种动物下呼吸道感染，并引起败血症、脑膜炎、关节炎、肺炎的症状，严重时会引起突发性死亡。人与发病动物接触或食用该菌污染的食品，亦可发病，因此该菌为一种重要的人畜共患病的病原。但是，目前尚缺乏快速、敏感的血清学检测方法。因此，研制快速、敏感的新型检测试剂盒是当务之急。

马链球菌兽疫亚种类M蛋白(SzP)高度抗酸，具有多种生物学功能。其表面有调理素表位，能刺激机体产生抗调理素抗体；能抑制补体C3b在菌体表面沉积，从而抑制机体补体系统的活化；能结合机体的纤维蛋白原，使其具有抗吞噬细胞的吞噬活性。类M蛋白是该菌重要的毒力因子和保护性抗原，而马链球菌兽疫亚种无毒菌株不表达类M蛋白。

基于上述原因，本发明人选取马链球菌兽疫亚种的类M蛋白为目标，通过大量实验，建立了检测感染马链球菌兽疫亚种的动物(主要是猪)的抗体的血清学方法。并在此基础上进一步优化，开发出了马链球菌兽疫亚种间接ELISA检测试剂盒。所述方法和试剂盒不仅可以用于该病原的抗体检测，还可以区分动物感染不同病原的血清学差别。

发明内容

本发明的目的在于提供马链球菌兽疫亚种快速检测的间接ELISA诊断方法。

一方面，一种用于检测马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)的酶联免疫试剂盒，其中包括：马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原和酶标二抗。

本发明所述试剂盒进一步还包括马链球菌兽疫亚种的标准阳性血清、阴性血清、洗涤液、封闭液、终止液、底物显色剂、浓缩样品稀释液和酶标板。。

在本发明中，所述酶标二抗的酶为辣根过氧化物酶。在一个具体实施方案中，所述的酶标二抗为HRP-SPA。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的洗涤液为含有0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的底物显色剂由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的浓缩样品稀释液为浓缩样品稀释液为含0.5％吐温一20的磷酸盐缓冲液。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的封闭液为含有5％的脱脂乳的磷酸盐缓冲液。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

另一方面，本发明还提供了一种检测马链球菌兽疫亚种的酶联免疫方法，该方法包括下列步骤：

(1)将本发明所述的马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原，用包被液稀释抗原至工作浓度1∶640，100μL/孔包被酶标板，37℃作用1小时后，4℃包被过夜，用洗涤液洗涤三次，每次5分钟，甩干；

(2)加入封闭液，200μL/孔，37℃作用2小时后，用洗涤液洗涤三次，每次5分钟，甩干；

(3)加入用血清稀释液稀释过的待检血清和标准阴、阳性血清，100μL/孔，37℃作用2小时后，用洗涤液三次，每次5分钟；

(4)加入1∶5000稀释的酶标抗体，100μL/孔，37℃，90分钟，用PBST洗板三次，每次5分钟；

(5)加入TMB可溶性单组份显色液，各加100μL/孔，室温避光显色30分钟；

(6)加入终止液100μL/孔，酶联免疫检测仪测OD₄₅₀值，根据与建立的判定标准的比对来判定阴性或阳性值。

其中所述的建立的判定标准是指：检测没有免疫链球菌疫苗，中和试验抗体检测为阴性的血清50份，求得其平均值为X＝0.202；标准偏差SD＝0.061；确定阴阳临界点为X+3SD＝0.202+3×0.061＝0.385，即待检血清OD₄₅₀值高于0.385判为阳性，OD₄₅₀值低于0.35判为阴性。

本发明中，所述的马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原是通过基因工程重组表达并纯化得到的。其中所述的基因工程重组表达的步骤包括：

(a)针对马链球菌兽疫亚种的类M蛋白编码基因的保守区片段设计并合成上下游引物