[发明专利]一种马链球菌兽疫亚种的酶联免疫检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于检测马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)的酶联免疫试剂盒，其中包括：马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原和酶标二抗。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其中所述试剂盒还包括马链球菌兽疫亚种的标准阳性血清、阴性血清、洗涤液、封闭液、终止液、底物显色剂、浓缩样品稀释液和酶标板。

3.根据权利要求1和2所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的酶标二抗的酶为辣根过氧化物酶。

4.根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的酶标二抗为HRP-SPA。

5.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的洗涤液为含有0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的底物显色剂由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。

7.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的浓缩样品稀释液为含0.5％吐温-20的磷酸盐缓冲液。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的酶联免疫试剂盒，其中所述的马链球菌兽疫亚种类M蛋白重组抗原的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

9.一种检测马链球菌兽疫亚种的酶联免疫方法，该方法包括下列步骤：

(1)将权利要求1中所述的重组蛋白抗原，用pH 9.6的0.05mol/L磷酸盐缓冲液稀释至工作浓度1∶640，100μL/孔包被酶标板，37℃作用1小时后，4℃包被过夜，用洗涤液洗涤三次，每次5分钟，甩干；

(2)加入封闭液，200μL/孔，37℃作用2小时后，用洗涤液洗涤三次，每次5分钟，甩干；

(3)加入用血清稀释液稀释过的待检血清和标准阴、阳性血清，100μL/孔，37℃作用2小时后，用洗涤液三次，每次5分钟；

(4)加入1∶5000稀释的酶标抗体，100μL/孔，37℃，90分钟，用PBST洗板三次，每次5分钟；

(5)加入TMB可溶性单组份显色液，各加100μL/孔，室温避光显色30分钟；

(6)加入终止液100μL/孔，酶联免疫检测仪测OD₄₅₀值，根据与建立的判定标准的比对来判定阴性或阳性值。

10.权利要求9所述的检测马链球菌兽疫亚种的酶联免疫方法，其中所述的建立的判定标准是指：检测没有免疫链球菌疫苗，中和试验抗体检测为阴性的血清50份，求得其平均值为X＝0.202；标准偏差SD＝0.061；确定阴阳临界点为X+3SD＝0.202+3×0.061＝0.385，即待检血清OD₄₅₀值高于0.385判为阳性，OD₄₅₀值低于0.35判为阴性。