[发明专利]用于确定LRRK2抑制剂的试验

说明书

本发明涉及用于评估LRRK2抑制剂的试验。

编码富亮氨酸重复序列蛋白激酶-2（LRRK2）的基因中的常染色体显性错义突变使人类易于患帕金森氏病[1,2]。LRRK2突变的患者通常患有帕金森氏病，其临床表现和症状不易区分于60-70岁左右的自发性帕金森氏病[3]。LRRK2突变占家族性帕金森氏病的4％，并在1%的散发性帕金森氏病患者中观察到LRRK2突变[3]。

LRRK2是一种较大的酶（2527个残基），其由富亮氨酸重复序列（残基1010-1287）、GTP酶结构域（残基1335-1504）、COR结构域（残基1517-1843）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域（残基1875-2132）和WD40重复序列（残基2231-2276）构成[4]。已报导了超过40种错义突变[5]。在之前的工作中，已使用各种类型的重组LRRK2对LRRK2的突变型亚群的活性以及定位进行分析，所述的各种类型的重组LRRK2使用多种方法表达和测定[4,32]。最常见的突变包括位于激酶结构域的亚结构域VII-DFG基序的高度保守的Gly2019进行氨基酸取代成Ser残基[5]，使LRRK2的蛋白激酶活性提高约2倍[6]。该发现表明LRRK2的抑制剂可用于治疗帕金森氏病。也报导了在分散的细胞溶质池中蓄积的各种突变体如LRRK2[R1441C]和LRRK2[Y1699C]，认为其由错误折叠的蛋白聚集体构成[6]。

在采用肽底物如LRRKtide[7]或Nictide[8]的试验中，可容易地在体外测定LRRK2固有的蛋白激酶催化活性；这还参见WO 2008/122789和PCT/GB2009/002047。这使得有可能进行筛选以确定抑制剂。最近的工作表明广泛分布的称为H-1152的Rho-激酶（ROCK）抑制剂也以相似的效价抑制LRRK2（IC₅₀为150nM）[8]。用于治疗肾细胞癌和其它癌症的多靶点酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼（商品名索坦，也称为SU11248）最近被证实可抑制LRRK2（IC₅₀为20nM）[8-10]。我们还发现H-1152和舒尼替尼对LRRK2[G2019S]突变体的抑制比野生型LRRK2强两到四倍[8]。根据LRRK2激酶结构域的分子模拟，我们设计了耐药性LRRK2[Ala2016Thr]突变体，其具有正常活性，但对H-1152的敏感度降低32倍，对舒尼替尼的敏感度降低12倍[8]。

由于对于LRRK2是如何被调节的以及其底物是什么了解甚少，因此开发LRRK2抑制剂的瓶颈是如何评估这些化合物在体内的相对有效性。我们提供了可用于在基于细胞的系统中评估的LRRK2抑制剂的方法。我们证明了LRRK2激酶活性调节邻近富亮氨酸重复序列结构域的两个N-端残基（Ser910和Ser935）的磷酸化，所述的磷酸化介导与磷适体14-3-3蛋白的结合[11]。与此一致的是，H-1152和舒尼替尼诱导Ser910和Ser935的去磷酸化，从而破坏14-3-3与野生型LRRK2和LRRK2[G2019S]的相互作用，但未破坏其与耐药性LRRK2[Ala2016Thr]突变体的相互作用。我们提供的证据表明破坏14-3-3的结合诱导LRRK2在胞质池中蓄积，这表现为与之前报导的LRRK2[R1441C]和LRRK2[Y1699C]突变体的胞质池相似。Ser910和Ser935的磷酸化或14-3-3结合，或LRRK2的亚细胞定位，可用于监测LRRK2抑制剂的效果。

本发明的第一个方面提供了用于评估试验化合物在基于细胞的系统中对LRRK2的作用的方法，所述方法包括步骤：

a）评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物对LRRK2的Ser910和/或Ser935的磷酸化状态的作用；和/或

b）评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物对LRRK2与14-3-3多肽结合的作用。

在某些实施方案中，该方法可包括或进一步包括评估将含有LRRK2的基于细胞的系统暴露于试验化合物中对LRRK2的亚细胞定位的作用的步骤。

所述方法可进一步包括选择认为对基于细胞的系统中的LRRK2具有抑制作用的化合物的步骤，其中如果LRRK2的Ser910和/或Ser935的磷酸化在暴露后降低；和/或LRRK2与14-3-3多肽的结合在暴露后降低，则选择该试验化合物。