[发明专利]一种高亲和力镰刀菌特异单链抗体及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体涉及一种高亲和力镰刀菌特异单链抗体，同时还涉及一种高亲和力镰刀菌特异单链抗体的制备方法，还涉及一种高亲和力镰刀菌特异单链抗体的用途。

背景技术

赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是世界温暖潮湿和半潮湿麦区广泛发生的一种危害小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avena sativa L.)、玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale L.)等谷类作物的真菌病害，影响作物的生长发育状况及籽粒质量，对经济生活造成严重的损失。在我国小麦感染赤霉病的面积达到700万hm²，约占全国小麦总面积的1/4。赤霉病是由多种镰刀菌引起的，禾谷镰刀菌亚洲种(Fusarium asiaticum)是我国小麦赤霉病的优势致病种群。禾谷镰刀菌侵染作物后可在籽粒上产生多种毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、伏马菌素(Fumonisins，FBs)、T-2毒素等，这些毒素能抑制真核生物细胞蛋白质合成，破坏人和动物的免疫系统，使人畜中毒，表现为呕吐、腹泻、免疫功能下降等，对人畜健康造成重大隐患。

目前赤霉病抗源匮乏极大地限制了小麦抗赤霉病育种的进展。迄今为止，还未发现对赤霉病完全免疫的小麦品种。以传统杂交方法培育抗性品种、对病原菌及其宿主载体喷洒化学农药和依靠农业轮作套种是常用的防控赤霉病的主要策略。随着生物科学，尤其是以基因工程为核心的生物技术的发展，将不同来源的抗病基因导入植物，在分子水平上定向重组遗传物质，相比传统育种和化学防控，其不受物种间屏障影响及减少对环境污染破坏，不仅节约时间和花费，而且更能赋予植物抵抗病原菌的广谱抗性和持久性。本课题组前期研究中已将禾谷镰刀菌细胞壁特异抗体CWP2基因(Accession number：AJ517190)通过基因工程技术导入小麦中，大田和温室接种试验证实转基因小麦抗赤霉病侵染的能力得到提高，并能提高产量。本发明通过对已有禾谷镰刀菌细胞壁特异抗体CWP2进行改造，获得了一种高亲和力的抗镰刀菌单链抗体，这为通过转基因方法培育小麦赤霉病高抗品种提供了新抗源。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种高亲和力镰刀菌特异单链抗体，此抗体与禾谷镰刀菌(Fusarium asiaticum)细胞壁蛋白的亲和力比亲本抗体CWP2(Accession number：AJ517190)高15倍。

本发明的另一个目的是在于提供了一种高亲和力镰刀菌特异单链抗体的制备方法，即利用Error-prone PCR和DNA shuffling技术对已有的抗体基因CWP2(Accession number：AJ517190)进行基因突变和序列重排。Error-prone PCR和DNA shuffling技术是在体外进行基因重组的一种技术，它通过体外模拟自然界几百万年的进化过程，在短时间内筛选出活性、稳定性、亲和力提高的蛋白，为人类服务。

本发明的再一个目的是在于提供了一种高亲和力镰刀菌特异单链抗体在培育小麦赤霉病高抗品种中的应用，本发明的单链抗体丰富了赤霉病抗源，为解决小麦赤霉病抗性种质资源匮乏以及转基因培育小麦赤霉病高抗品种奠定基础。

一种高亲和力镰刀菌特异单链抗体的制备方法，其步骤是：

A、利用Error-prone PCR和DNA shuffling技术对禾谷镰刀菌细胞壁特异抗体CWP2(Accession number：AJ517190)进行基因突变和序列重排。

B、将基因突变和序列重排后的突变基因连入噬菌体展示必需的载体中，电转化大肠杆菌感受态，构建突变抗体库。

C、利用噬菌体展示技术对突变抗体库进行淘选，经过三轮淘选富集得到与禾谷镰刀菌细胞壁蛋白特异结合的突变体蛋白。

D、Phage-ELISA技术鉴定挑选到的突变体与禾谷镰刀菌细胞壁蛋白的结合能力。

E、Phage-ELISA技术鉴定为阳性的克隆做表达ELISA鉴定，辨别其与亲本单链抗体CWP2对禾谷镰刀菌细胞壁蛋白结合能力的强弱。

F、表达ELISA鉴定为高亲和力的单链抗体与禾谷镰刀菌细胞壁蛋白做Western blot分析，证明了此抗体能够与禾谷镰刀菌细胞壁中一种主要蛋白结合。