[发明专利]KLK14蛋白亲和层析纯化人重组SPINK6蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白的纯化方法，具体涉及人重组SPINK6蛋白的亲和层析纯化方法。

背景技术

肿瘤是目前人类死亡率最高的疾病之一，现有的药物对肿瘤的治疗效果较差，特别是在肿瘤的复发和转移方面缺少有效的手段。市场迫切需要新型的治疗肿瘤的药物。

丝氨酸蛋白酶抑制物Kazal型(SPINK)家族与慢性胰腺炎，食管癌等疾病关系密切。该家族主要由SPINK1、SPINK2、SPINK4、SPINK6等亚家族组成。SPINK6基因序列是NCBI于2006年公开的一个人源基因序列，其序列在文献：(Martin C.Wapenaar，Alienke J.Monsuur et al；Immunogenetics，2007，59：349-357)中有详细的报道。有研究发现了SPINK6蛋白的抗肿瘤活性(专利申请号：PCT/CN2009/074410)。该研究实验结果表明：当SPINK6基因在癌细胞株中过量表达时，使得癌细胞株失去了在软琼脂上形成克隆、在裸鼠体内成瘤能力，用基因工程的方法表达得到的重组SPINK6蛋白也可以有效抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤；其中(专利申请号：PCT/CN2009/074410)还构建了一种含有SPINK6基因的大肠杆菌和酵母菌的基因工程菌，并成功表达了重组SPINK6蛋白。但是上述研究方法中没有明确详细的阐明纯化方法，实际的纯化过程中存在纯化效率低、回收率差、纯度只能达到80％左右，尚不能满足药用的纯度要求。因此寻找一种专一性好、产品纯度高、样品吸附量大的重组SPINK6蛋白的纯化工艺是目前本技术领域中十分迫切需要解决的难题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的上述缺陷，主要解决的技术问题是公开一种KLK14蛋白亲和层析纯化人重组spink6蛋白的方法。

本发明的技术方案是这样的：

最新的研究结果表明，SPINK6蛋白作为激肽释放酶(KLK)家族的特异性抑制剂在皮肤角质层组织中发挥重要作用，其对KLK14的抑制作用尤为明显。本发明通过实验证明，当SPINK6与KLK14蛋白1∶1孵育时，即可基本完全抑制KLK14的活性。在此基础上，本发明通过偶联有KLK14蛋白的亲和填料纯化人重组SPINK6蛋白，旨在获得高纯度的人重组SPINK6蛋白从而满足后续体内实验。

具体而言，本发明的KLK14蛋白亲和层析纯化人重组SPINK6蛋白的方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)制备亲和层析介质

本发明中，参考GE公司出版的CNBr活化的Sepharose4B的使用说明书，进行亲和层析介质的制备。具体步骤如下：将亲和介质用pH2.0-3.0的HCl溶液进行溶胀、清洗，HCl溶液的用量为亲和介质的50-100倍体积量，然后用亲和介质的10-20倍的体积量的偶联液进行清洗，使亲和层析介质的pH达到7.5-10.0；

所用的偶联液为含有0.15-0.6M NaCl的NaHCO₃溶液(pH8.0-10.0)；

将人重组KLK14蛋白以重量比1∶200-400溶解在偶联液中，然后与上步用偶联液清洗过的亲和介质混合，在室温条件振荡0.5-2小时，或于4℃条件下放置12-36小时，使人重组KLK14蛋白与亲和介质偶联充分；然后用偶联液清洗制得的亲和层析介质，偶联液用量为制得的亲和层析介质体积的5-20倍；再用亲和介质体积1-5倍的0.5M-1M的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)或1-2M乙醇胺溶液浸泡放置2-4小时，用于封闭亲和层析介质中未被结合的活性位点；

所说的人重组KLK14蛋白购自R&D公司，人重组KLK14蛋白与亲和层析介质的重量比为1∶20-150；

所说的亲和层析介质选自交联琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、丙烯酰胺聚合物、共聚物及其衍生物、聚甲基丙烯酸酯衍生物、聚醚砜或脱乙酰壳多糖中的一种或一种以上。

(2)人重组SPINK6蛋白用亲和层析介质进行纯化

用0.01-0.1mol/L pH7.0-9.0含0.05-0.15mol/L NaCl缓冲液A平衡装有亲和层析介质的层析柱；

将人重组SPINK6蛋白样品以10-75cm/h上样至预平衡好的层析柱；

所说的单位cm/h为流速单位，即缓冲液每小时通过介质材料的高度。然后用0.01-0.1mol/L pH7.0-9.0含0.05-0.15mol/L NaCl的缓冲液A清洗上样后的亲和层析柱；