[发明专利]一种利用PCR-RFLP技术鉴别西花蓟马品系的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用PCR-RFLP技术鉴别西花蓟马品系的方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

西花蓟马(Frankliniella occidentalis)，其属于缨翅目(Thysanoptera)蓟马科(Thripidae)花蓟马属(Frankliniella)，最初起源于美国西部，20世纪80年代开始迅速扩散至全球各大洲，目前已在69个国家和地区有报道，是当今世上对作物危害最严重的世界性害虫之一(Kirk，2001；Kirk and Terry，2003)。该害虫不仅取食寄主植物汁液，在果实表明形成伤痕，降低果品质量，而且能以持久性的方式传播番茄斑萎病毒病(TSWV)和凤仙花坏死斑病毒(INSV)(Kritzman A，2002)。并且，传播的病毒所造成的经济损失远远大于其本身所造成的损失。我国农业部于1996年将其列为进境地植物检疫潜在性害虫。

Brunner等(2010)基于mtCOI基因序列发现世界各地西花蓟马种群存在2个遗传支系，并建议将这2个遗传支系定义为2个生态型(ecotypes)，而Rugman-Jones等(2010)建议将其定义为2个种。为了论述方便，本专利文件中分别将其称为G型和L型。资料表明，G型和L型西花蓟马在产卵量、寄主适应性、生境适应性、抗药性等生物学方面存在差异(deKogel et al.，1997；Brdsgaard，1994；Brunner et al.，2010；Rugman-Jones et al.，2010)。因此准确区分两种类型，对于进一步研究其入侵机制和生物学具有重要的理论意义与参考价值。目前，两种类型西花蓟马从形态学上无法明确的区分，仅可以从分子遗传学角度区分。Rugman-Jones等(2010)基于rDNA 28s设计了一组引物，通过PCR扩增，检测PCR产物的多态性来区分两种类型。此方法区分了美国原产地两种类型的西花蓟马。

PCR-RFLP(限制性片段长度多态性聚合酶链反应)技术，又称为CAPS技术(Cleaved Amplilfed Polymorphism Sequences)，它实质上是PCR技术与RFLP技术结合的一种方法。它的基本原理是先利用已知位点的DNA序列资源(基因数据库、基因组或cDNA克隆及克隆的RAPD条带等)设计一套特异性的PCR引物(19～27bp)，然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。该技术揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息。PCR-RFLP是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度-能够揭示单个碱基的差异。另外，由于很多限制性内切酶均可与DNA扩增片段酶切，所以检测到多态性机会较大(赵淑清，2000)。

PCR-RFLP技术已经广泛应用于植物、动物、微生物以及昆虫的物种检测与鉴定、遗传分化鉴定等方面(王孝宣，2003；张婷，2005；马玉红，2006；滕齐辉，2006)。利用该技术已区分和鉴定出了西花蓟马、美棘蓟马、烟蓟马和棕榈蓟马等物种(Moritz，2000；Brunner，2002；Toda and Komazaki，2002)。PCR-RFLP技术同样适用于物种以下介元的区分。周建峰等(2003)运用PCR-RFLP方法分析了3个亚种线粒体DNA的DNA5/6区段，利用3种内切酶，区分了3个鲤鱼亚种。但利用PCR-RFLP技术构建区分西花蓟马两个品系的方法目前还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用PCR-RFLP技术鉴别西花蓟马品系的方法。

术语解释：

G型西花蓟马：目前将组成西花蓟马入侵种主体的西花蓟马品系称为温室系(greenhouse strain)，本专利文件中称其为G型西花蓟马。

L型西花蓟马：因该品系最早发现与新西兰的羽扇豆上，并表现出与温室系差异明显的生物学特性，故将其称为羽扇豆系(lupin strain)，本专利文件中称其为L型西花蓟马。

一种利用PCR-RFLP技术鉴别西花蓟马品系的方法，步骤如下：

(1)提取西花蓟马基因组DNA；

(2)以西花蓟马基因组DNA为模板对其线粒体COI基因进行PCR扩增；

PCR体系中，引物序列如下：

正义引物：5’GGATCACCTGATATAGCATTCCC3’；SEQ ID NO.1