[发明专利]一种反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达方法

权利要求书

1.一种反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达的方法，所述方法包括步骤：

标本收集及纯化；

反转录反应；

反转录阴性对照和阳性对照；

反转录产物进行实时定量PCR检测；

使用组织细胞RNA进行优化PCR条件；

在该条件下同时放大扩增阴性对照和阳性对照；

采用相对定量的方法检测目的基因的表达量；以及

进行统计学分析。

2.如权利要求1所述的反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达的方法，其中所述标本收集及纯化的步骤包括：

临床常规收集标本，经过至少三次预冷的PBS溶液洗涤，通过超细的玻璃吸管将单个受精卵或植入前胚胎或胚胎细胞，总容量为0.1μL，转移到0.9μL的RNA抽提液当中，经过液态氮处理后收集全部RNA；其中，所述抽提液为1×PCR缓冲液中加入0.1IU RNA酶抑制剂。

3.如权利要求2所述的反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达的方法，其中所述标本收集及纯化的步骤进一步包括：

将收集的RNA用RQ1 RNase-Free DNase Kit进一步纯化，每个胚胎或胚胎细胞RNA用0.1IU RQ1 RNase-Free DNase，加0.1μL的缓冲液；经过37℃下10分钟，加0.1μL终止液，95℃下1分钟。

4.如权利要求1所述的反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达的方法，其中所述反转录反应的反应体系为：

模板1.3μl，反转录酶2.5U，随机引物2.5μM，dNTPs0.5μM，Mg++4mM，RNase抑制剂0.2U，10xPCR缓冲液0.4μl，加Milli Q超纯水至终体积4μl。

5.如权利要求4所述的反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达的方法，其中所述反转录反应的反应条件为：25℃下10分钟；然后42℃下2分钟；然后99℃下2分钟以及4℃下10分钟。 

6.如权利要求1所述的反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达的方法，其中在反转录阴性对照和阳性对照时，反转录阴性对照不加入反转录酶或RNA模板，阳性对照以组织细胞RNA为模板。

7.如权利要求1所述的反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达的方法，其中在反转录产物进行实时定量PCR检测步骤中，反转录产物进行实时定量PCR反应体系如下：模板(cDNA)2μl，Taq DNA polymerase 0.75IU，引物1μM，dNTPs 0.5μM，DMSO0.05μl，Mg⁺⁺2mM，荧光染料SYBR green 0.1μl，10xPCR缓冲液1μl，加MilliQ超纯水至终体积10μl。

8.如权利要求1所述的反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达的方法，其中在使用组织细胞RNA进行优化PCR条件步骤中，所用的PCR条件如下：

。

9.如权利要求8所述的反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达的方法，其中在该优化条件下放大扩增阴性对照和阳性对照时，所述阴性对照不加入反转录酶或RNA模板，所述阳性对照包括Housekeeper基因，和目的基因在已知的组织细胞中的表达。

10.如权利要求1所述的反转录PCR分析IVF单个植入前胚胎的基因表达的方法，其中采用相对定量的方法检测目的基因的表达量的步骤包括计算出组织细胞中检测目的基因与Housekeeper基因的阈值差，和胚胎中检测目的基因与Housekeeper基因的阈值差，采用相对定量2^-ΔΔct的方法检测目的基因的表达量。