[发明专利]奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于环介导等温扩增检测技术领域，尤其涉及了可视化环介导等温扩增（LAMP）检测技术在海水贝类奥尔森派琴虫检测中的应用。

背景技术

派琴虫是影响贝类养殖业发展的主要病原，为世界动物卫生组织规定的必报水生动物疫病之一，可感染蛤仔、扇贝、牡蛎、鲍鱼、贻贝等贝类。在欧洲、美洲和亚洲等海域均有过贝类感染的报道。2000年，我国黄海沿岸爆发了菲律宾蛤仔的大规模死亡，派琴虫是其中危害最大的病原生物之一。

在我国，目前由于派琴虫的检测技术有液体巯基醋酸盐培养基(RFTM)培养方法、PCR/荧光PCR检测方法。如中国专利申请号为2008102246547公开了一种用于派琴虫检测的实时荧光PCR引物和探针，所述的引物对特异性针对派琴虫基因组DNA中ITS2序列的保守区域，所述探针特异性针对于该引物对扩增区域中的GC高含量区，该探针的5’端具有报告荧光染料标记，3’端具有淬灭荧光染料标记。但是液体巯基醋酸盐培养基(RFTM)培养方法即可培养派琴虫，也可以培养某些双鞭毛类，缺乏专一性，而且仅能检测到派琴虫的休眠孢子，同时RFTM检测方法需要7天时间，敏感度较低，只有当每克组织内原虫数量高于1000个时方可检出，因此在实际工作中具有一定的局限性。对于PCR/荧光PCR检测方法，虽然其敏感性高、特异性强，但是其通常需要昂贵、精密的一起设备，对实验环境和操作者技术要求也比较高，同时，由于PCR相关反应需要经过DNA的热变性、长时间的温度循环等等，耗时较长，从3小时到20小时不等，不利于食品中毒的现场快速诊断和处理，所以目前情况来看，在实验室研究中应用较多，在食品卫生实际检验中由于相对要求比较高，推广应用上有一定难度。

环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由日本的荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发出来的一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60分钟左右即可核酸扩增，效率可达10⁹～10¹⁰个数量级，具有操作简单、特异性强、快速灵敏、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核酸三磷酸基质中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色；或在有钙黄绿素、SYBR Green等颜色指示剂存在的情况下，反应产物呈现出特定的颜色。因此，可以把浑浊度或颜色作为反应的指标，只用肉眼观察到白色浑浊沉淀或特定颜色，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和染色过程。LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。但是，目前尚未见有利用环介导等温扩增（LAMP）对贝类奥尔森派琴虫进行检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种更方便、特异性强、成本低、通过肉眼直接检测荧光来判断结果的奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增（LAMP）检测试剂及检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂，针对奥尔森派琴虫的5.8S核糖体RNA与内转录2间隔区序列，设计6条特异性LAMP扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB；所述扩增引物的核苷酸序列分别为：

F3为5'-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3'，

B3为5'-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3'；

FIP为5'-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3'，

BIP为5'-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3'；

LF为5'-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3'，

LB为5'-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3'。

所述的扩增引物加入反应试剂后共同组成LAMP检测液体系，所述的反应试剂包括反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、颜色指示剂。

所述的颜色指示剂为钙黄绿素和氯化锰，或是SYBR Green。SYBR Green是高灵敏的DNA荧光染料，应用于DNA和RNA的检测，这些试剂可以在市场上购买得到。