[发明专利]奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂及检测方法

权利要求书

1.奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂，其特征在于：针对奥尔森派琴虫的5.8S核糖体RNA与内转录2间隔区序列，设计6条特异性LAMP扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB，所述的F3为5'-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3'，所述的B3为5'-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3'，所述的FIP为5'-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3'，所述的BIP为5'-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3'，所述的LF为5'-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3'，所述的LB为5'-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3'。

2.根据权利要求1所述的奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂，其特征在于：所述的扩增引物加入反应试剂后共同组成LAMP检测液体系，所述的反应试剂包括反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、颜色指示剂。

3.根据权利要求2所述的奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂，其特征在于：所述的颜色指示剂为钙黄绿素和氯化锰，或是SYBR Green。

4.根据权利要求3所述的奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂，其特征在于：所述的LAMP检测液体系中的各组分浓度分别为：F3 0.1μmol/L～2μmol/L，B3 0.1μmol/L ～2μmol/L，FIP 0.8μmol/L～16μmol/L，BIP 0.8μmol/L～16μmol/L，LF 0.4μmol/L～8μmol/L，LB 0.4μmol/L～8μmol/L，反应缓冲液Bst DNA polymerase buffer 1×、链置换DNA聚合酶 1U～40U、镁离子0.6 mmol/L～7 mmol/L、甜菜碱0.1 mmol/L～2 mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0.2 mmol/L～2 mmol/L、钙黄绿素6μmol/L～70μmol/L和氯化锰0.05 mmol/L～1 mmol/L，或1×～10×SYBR Green代替钙黄绿素6μmol/L～70μmol/L和氯化锰0.05 mmol/L～1 mmol/L。

5.根据权利要求3所述的奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂，其特征在于：所述的LAMP检测液体系中的各组分浓度分别为：F3 0.6μmol/L，B3 0.6μmol/L，FIP 4.8μmol/L，BIP 4.8μmol/L，LF 2.4μmol/L，LB 2.4μmol/L，反应缓冲液Bst DNA polymerase buffer 1×、链置换DNA聚合酶8U、镁离子4mmol/L、甜菜碱0.2mmol/L、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0.8mmol/L、钙黄绿素25μmol/L和氯化锰0.25mmol/L，或4×SYBR Green代替钙黄绿素25μmol/L和氯化锰0.25mmol/L。

6.一种用权利要求1～5任一所述的奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂的检测方法，其特征在于：所述检测方法的检测步骤包括：

(1)提取待检样品的基因组DNA；

(2)配制LAMP检测液体系；

(3)在LAMP检测液体系中加入步骤（1）提取的待检样品基因组DNA；

(4)将步骤（3）配制的反应体系混合均匀；

(5)将步骤（4）的反应体系置于恒温设备；

(6)按反应程序进行扩增反应，反应程序依次为： 55℃～70℃  30min～120 min， 80℃～100℃  5min，10℃ 5min； 

(7)反应结束后，根据颜色反应判断检测结果，判断标准为：肉眼直接观察或在紫外光下观察，呈现黄绿色荧光的样品判断为奥尔森派琴虫感染阳性样品，反之为阴性样品。