[发明专利]胶原蛋白海绵的制备工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种胶原蛋白海绵的制备方法，属于蛋白质工程领域，该产品 由保持三螺旋结构的活性胶原经交联制得，具有低免疫原性、高生物相容性， 可生物降解，适用于医疗用途。

背景技术

胶原是脊椎动物体内含量最丰富、分布最广泛的一组硬蛋白，分子量约为 300000，均可在细胞外形成超分子聚集物，大量存在于骨、软骨、肌腱及皮肤 中，占人体或其他动物体总蛋白含量的25％-33％。同一组织中常含有几种类型 的胶原，常以某种为主。I型胶原遍布于肌体的各部分，主要为皮肤、肌腱及 韧带中，具有很强的抗张能力。II型胶原主要存在于透明软骨、玻璃体中，具 有较强的抗压能力。III型胶原广泛分布于伸展性大的组织中，如疏松结缔组织 等，具有伸展性及应变性。其中，I型胶原占生物体总胶原量的90％，因此， I型胶原在生物材料中的使用也最广泛。

胶原在分子水平结构相同，由3条a链多肽组成，每一条胶原链都是左手 螺旋构型。3条左手螺旋链又相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构为胶原 蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定。3条链富含甘氨酸、脯氨 酸和丙氨酸，缺乏半胱氨酸和色氨酸，酪氨酸含量也很低，但含独特的羟化氨 基酸(羟脯氨酸和羟赖氨酸)。由于原纤维的方向性和成束直径及密度的不同，不 同组织的胶原存在结构差异，并具有各自的功能和结构特征。在结缔组织中， 胶原除了机械支撑外，还是细胞粘附和移动的重要物质基础，因此，胶原被认 为是胚胎发育和组织再生中重要的形态发生因素，在组织工程中得到广泛应用。

胶原蛋白海绵主要成分是胶原蛋白，它与人体胶原蛋白结构相似很适合人 体器官的修复和再生。胶原蛋白能促进伤口愈合和肉芽组织的生长，具有良好 的止血和填充作用，可用于促进创面愈合、止血、手术残腔填充等。在制备多 孔支架的过程中应考虑支架材料以及支架的三维结构对细胞活性的影响。对一 个可以促进细胞粘附和生长的具有生物活性的支架来说，必须具有良好的生物 相容性，且能够保持一定的体内降解速率。支架应具有适当的平均孔径，使细 胞在孔间进行迁移的同时保持恰当的细胞粘附面积，胶原蛋白海绵被公认为是 一种优质的医用材料。

CN101005865A中公开了一种胶原蛋白海绵的制备方法，以戊二醛进行交 联，其胶原提取效率和纯度都较低，交联剂使用戊二醛安全性较低。现有技术 公开的方法在胶原的提取制备过程中往往破坏胶原的三螺旋结构，或者提取效 率较低，无法实现既能够保留活性胶原的三螺旋结构，又同时提高提取效率和 纯度，并以此胶原经酶法交联制备安全的胶原蛋白海绵。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的是提供一种胶原蛋白海绵的制备方法。本发 明使用酸酶结合处理加渐进式超声波处理的制备方法，不仅能够保持胶原的三 螺旋结构，同时显著的提高了胶原的提取效率，并经过酶法交联，制备胶原蛋 白海绵。本发明使用H₂O₂溶液处理加酸溶盐析纯化加透析纯化有效的提高了胶 原产品的纯度，保证了胶原蛋白海绵良好的生物相容性。

一种胶原蛋白海绵的制备方法，包括如下步骤：原料预处理、除脂、酸酶 结合处理、超声波处理、H₂O₂溶液处理、酸溶盐析纯化、透析纯化、酶法交联、 干燥。

所述的原料为选自新鲜猪皮、牛皮、牛跟腱中的一种。

所述的酸酶结合处理为：经过预处理的原料浸入0.6～0.7mol/L冰醋酸和 600～700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌25～30小时左右。

所述的超声波处理优选采用渐进式超声波处理，先使用100～200W超声处 理30分钟，再使用200～300W超声处理30分钟，最后使用300～400W超声处 理1小时。

所述的胶原蛋白海绵的制备方法，具体步骤如下：

(1)取新鲜猪皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将猪皮破 碎成小颗粒状，按照固液比1∶30～1∶40的比例，加入0.01～0.03mol/L的氢氧化钠 水溶液，于6～8℃浸泡1～2小时，过滤，备用；

(2)在上述预处理后的猪皮中加入质量为猪皮质量6～8倍的无水乙醚或者 丙酮，于35～40℃回流5-8小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用；