[发明专利]大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖病害防控领域，具体涉及到一种大鲵病毒性出血病的细胞培养灭活疫苗，同时还涉及该灭活疫苗的制备方法，以及该大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗的用途。本发明所用的鲤上皮瘤细胞系(EPC)由武汉大学保藏中心保藏，保藏号为：CCTCCGDC0174；大鲵病毒性出血病毒病原——大鲵虹彩病毒由本实验室从患典型出血病的大鲵体内分离并鉴定，由武汉大学保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC V201134。

背景技术

大鲵(Chinese giant salamander)是我国特有的珍稀水生两栖类动物，俗称“娃娃鱼”，属于国家二级保护动物。大鲵肉质细嫩、营养丰富，并且具有很高的药用价值，也是水生动物向陆生动物过渡的类型，对研究物种进化有重要意义。随着国家对大鲵人工繁育驯养以及经营利用的许可，目前大鲵已经成为一种珍贵的水产养殖品种，在全国20多个省市都有养殖，市售价格约在2400元/kg，养殖效益非常可观。同时，由于大鲵养殖业规模的不断增加和集约化程度的提高，疾病成为制约养殖更大发展的瓶颈。近5年来，许多养殖场都暴发了大鲵病毒性出血病。该病传染性强且死亡率高，对大鲵养殖业造成了巨大的经济损失。我们通过病原学研究发现，此病由大鲵虹彩病毒感染引起，并分离鉴定了大鲵虹彩病毒。该病目前尚无有效的药物治疗方法。

疫苗免疫被认为是控制水生动物病毒性传染性疾病的最佳手段。建立大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗的制备方法，制备大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗，对于开展疫苗的规模化生产与病害的免疫预防有重要意义。细胞培养灭活疫苗由于其生产成本低、工艺简单且安全性能好，可广泛应用于水产养殖中疾病的防控。

目前尚未见到大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗的相关报道，本发明首次利用鱼类细胞系，建立了一种高效、安全、可规模生产的大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗的制备方法，并制备出大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗，该疫苗含完整的病毒抗原蛋白，在效价为10⁵TCID₅₀/ml时免疫效果好。此外用亚硫酸钠NaSO₃中和残余福尔马林，消除了灭活剂自身的毒性，提高了疫苗的安全性。

本发明提供了一种大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗的制备方法。本发明制备疫苗的生产周期短，生产工艺简单，获得疫苗的数量多，疫苗的安全性与免疫原性好，该方法使用0.2％(V/V)的灭活剂福尔马林于37℃灭活48-72小时即可达到完全灭活病毒的目的。该方法简单快捷，灭活彻底，并且不破坏抗原蛋白的完整性。

本发明还有一个目的是在于提供了一种大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗在制备治疗或预防大鲵病毒性出血病药物中的应用。通过应用该疫苗对大鲵苗种进行注射免疫，其免疫保护率达82％，浸泡免疫的保护率达73％。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗的制备方法，其步骤是：

A.EPC细胞复苏：取液氮中保存的EPC细胞，37℃温育2～3分钟使其融化，加入含10％(V/V)小牛血清的MEM(Eagle′s minimum essential medium，Sigma)培养液(5ml/T₂₅培养瓶，pH7.2～7.5)，转移至培养瓶中25～26℃静置6～8小时培养，待细胞贴壁后换新鲜培养液。在细胞培养2～3天铺满培养瓶底后，用胰蛋白酶消化法进行传代培养。

B.EPC细胞培养：取长满单层的鲤鱼上皮瘤细胞2瓶，在无菌超净台里吸弃旧培养基，每瓶添加2ml浓度为0.25％(V/V)胰酶消化液，在显微镜下观察发现细胞解离形成单个细胞后，迅速添加2ml含10％(V/V)小牛血清的MEM培养基中和胰酶，用移液管轻吹细胞瓶底，收集细胞悬液至15ml离心管里，1000r/min离心5min。离心结束后，吸弃上上清液，添加4-6ml含10％(V/V)小牛血清的MEM培养基悬浮细胞沉淀。取4个T25细胞培养瓶，每瓶加4ml新鲜配置的培养基再添加1-1.5ml细胞悬液，置于25℃培养箱中培养，待细胞形成汇合单层后，用于扩增大鲵虹彩病毒。