[发明专利]大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗及制备方法和应用

权利要求书

1.一种大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗，其特征在于：中国大鲵(Andrias davidianus)，CCTCC V201134。

2.根据权利要求1所述的一种大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗，其特征在于：所述的灭活疫苗含有鲤上皮瘤细胞系(EPC)，CCTCC GDC0174。

3.权利要求1所述的一种大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗的制备方法，其步骤是：

A.EPC细胞复苏：取液氮中保存的EPC细胞，37℃温育2～3分钟使其融化，加入含10％V/V小牛血清的MEM培养液：5ml/T₂₅培养瓶，pH7.2～7.5，转移至培养瓶中25～26℃静置6～8小时培养，在细胞培养2～3天铺满培养瓶底后，用胰蛋白酶消化法进行传代培养；

B.EPC细胞培养：取长满单层的鲤鱼上皮瘤细胞，在无菌超净台里吸弃旧培养基，每瓶添加2ml浓度为0.25％V/V胰酶消化液，添加2ml含10％V/V小牛血清的MEM培养基中和胰酶，用移液管轻吹细胞瓶底，收集细胞悬液至15ml离心管里，1000r/min离心5min，离心结束后，吸弃上上清液，添加4-6ml含10％V/V小牛血清的MEM培养基悬浮细胞沉淀，取4个T25细胞培养瓶，每瓶加4ml新鲜配置的培养基再添加1-1.5ml细胞悬液，置于25℃培养箱中培养，细胞形成汇合单层后，用于扩增大鲵虹彩病毒；

C.GSIV病毒扩增：待EPC传代细胞在瓶底铺满时，吸出培养液，然后按1/10的培养基体积加入感染的病毒悬液，病毒的感染复数MOI为1～5PFU/cell，在病毒吸附细胞40～60分钟后，补加含2％V/V小牛血清的MEM维持液进行病毒增殖；

D.GSIV病毒的收获：病毒连续培养3-6天，在显微镜下观察，待鲤鱼上皮瘤细胞出现典型细胞病变效应时，将T25细胞瓶置于-80℃冰箱冻存，结冻后取出细胞瓶放室温溶解，反复冻融两次，在超净台里用移液管轻吹培养瓶壁，将病毒感染的细胞悬液装入50ml无菌离心管里，以4000r/min离心20min，收集离心后上清液，获得扩增病毒液，用于后续滴度实验以及灭活疫苗制备；

E.病毒滴度测定：将待测病毒液进行一系列10倍稀释10^-1～10^-10，在96孔板上感染EPC细胞，在病毒感染24～120小时内，按Reed-Muench法计算病毒滴度TCID₅₀值，病毒滴度为灭活疫苗的效价；

F.GSIV病毒的灭活：取100ml大鲵虹彩病毒原液，加入0.2ml福尔马林，使其终浓度为0.2％V/V，混合均匀后置于37℃条件下灭活48-72h，待灭活结束后添加终浓度为0.05％的亚硫酸钠中和残余福尔马林，获得大鲵虹彩病毒灭活疫苗原液，并置于4℃冰箱保存备用；

G.灭活病毒疫苗的使用：将灭活好的疫苗用鱼用生理盐水0.65％稀释至效价为10⁵TCID₅₀/ml，得到直接使用的大鲵细胞培养灭活疫苗。

4.权利要求1所述的一种大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗在制备治疗或预防大鲵病毒性出血病药物中的应用。