[发明专利]油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂及检测试剂盒和应用

说明书

技术领域

本发明涉及病原真菌的检测技术，具体涉及涉及油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂及检测试剂盒和应用。

背景技术

油棕猝倒病菌（Pythium splendens），又称华丽腐霉，是油棕上的一种重要病害，该病菌寄主范围很广，除侵染油棕（Elaeisguineensis）以外，还能够侵染玉米（Zeamays）、向日葵（Helianthusannuus）、大麦（Hordeumvulgare）、黄瓜（Cucumissativus）、番薯（Ipomoeabatatas）、小麦（Triticumaestivum）、蚕豆（Viciafaba）、豇豆（Vignasinensis）、辣椒属（Capsicum spp.）、烟草（Nautilocalyxlynchei）、天竺葵属（Pelargonium spp.）、秋海棠属（Begonia spp.）等250余种植物，引起寄主幼苗整株失水萎蔫及根部、茎基部、切口变褐腐烂与皮层脱落等症状。目前，该病菌主要分布在比利时、法国、德国、意大利、荷兰、日本、坦桑尼亚、刚果和美国的夏威夷、弗罗里达、宾夕法尼亚州，国内台湾、海南曾有报道，但其他地区未见发生报道，为我国进境植物检疫性有害生物。

油棕猝倒病菌的检测方法主要包括传统的形态学特征结合生理生化性状的生物学鉴定和特异性引物PCR、核糖体DNA序列分析、RFLP等。生物学鉴定方法耗工费时，而且某些形态特征不稳定，可能退化或消失，并且油棕猝倒病菌为异宗配合型，单性培养不能产生有性器官，更增加了其鉴定难度；Wang等研制的特异性引物PCR灵敏度不是很高，无法检测较低含量的DNA样品；核糖体DNA序列分析，虽然获得生物信息量大，但是实验操作繁琐，检测周期长；RFLP可省去序列分析中许多繁琐工序，但是需要进行多种酶切也费时费工，并且以上的分子检测方法都要进行电泳等PCR后处理，接触有毒试剂溴化乙锭，还易发生交叉污染而造成假阳性结果。

荧光定量PCR（Real-time fluorescent PCR）是近几年发展起来的PCR技术与荧光检测相结合的方法，其原理是使用能特异标记核苷酸序列的荧光物质，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，具有检测周期短、特异性与灵敏度高以及无需PCR后处理等优点。以TaqMan水解探针为例，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通常状态下，荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移现象，荧光基团的荧光被淬灭基团吸收。当PCR进入退火阶段时，荧光探针特异的结合在两条引物之间，在延伸阶段被聚合酶的5′端外切酶活性切开。荧光基团与淬灭基团分离，仪器检测出荧光。由于荧光信号伴随着PCR模板的扩增而增长，因此可以根据荧光信号是否增长来确定模板是否扩增。荧光PCR仪在反应过程中连续的检测荧光信号的变化，当荧光信号增强到某一阈值时，此时的循环次数（Ct）就被记录下来。该Ct值与反应体系中起始模板量的对数值有严格的线性关系。因此，除了可定性确定反应体系中是否含有目标DNA之外，还可以对反应体系中的模板DNA进行相对定量。因此，研究建立特异、敏感、可对低含量P. splendens直接进行检测的方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究等方面具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对油棕猝倒病菌具有特异性高、敏感性强，定量和快速检测的荧光定量PCR检测试剂。

本发明还提供了含有该检测试剂的检测试剂盒和应用。

本发明系选择油棕猝倒病菌ITS区保守片段为靶目标，应用primer Express 5.0软件，设计合成引物和探针。将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最合适的引物和探针。

本发明所述的油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为94bp，一对特异性引物序列pyspF：5’-ttaaatggac agggtctttc tat-3’和pyspR：5’-tgccgaagtc gccaaaag-3’，特异性探针序列pyspT：5’-FAM-cgagcaccac acttcacaca g-TAMRA-3’。

本发明所述的油棕猝倒病菌荧光定量PCR检测试剂的引物和探针制备：