[发明专利]表达gp64基因的新型基因工程重组病毒的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物杀虫剂的遗传改良领域，具体涉及一种在杆状病毒组II核多角体病毒（group II NPV）中表达组I核多角体病毒（group I NPV）的囊膜糖蛋白基因gp64的构建方法。该表达组I核多角体病毒（group I NPV）毒株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中科院微生物研究所，100101）。保藏日期是2011年6月 24 日，保藏号为：CGMCC No：4976。

背景技术

杆状病毒的天然宿主大部分是农林业的害虫。1973年，杆状病毒被联合国粮农组织和世界卫生组织推荐为化学农药的理想替代品。目前，我国已有6种杆状病毒杀虫剂正式登记注册。杆状病毒对宿主昆虫具有专一而强烈的致病性，能够在环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物安全无害，不污染环境，是理想的“生物农药”。然而，杆状病毒杀虫速度较慢、杀虫谱窄，严重阻碍其大规模应用。

在杆状病毒出牙型病毒粒子（BV）囊膜的表面，存在许多由糖蛋白组成的刺突状结构，它们在介导病毒与受体结合，膜融合及出芽等过程发挥关键作用。group I NPV BV的主要囊膜糖蛋白为GP64，group II NPV BV的主要囊膜糖蛋白是F蛋白。GP64和F蛋白均是低pH诱导的膜融合蛋白。研究表明，GP64比F蛋白具有更强大的膜融合能力，而含有GP64的group I代表株 AcMNPV与含F蛋白的group II代表株HearNPV相比，具有更广的宿主域和更高的杀虫活性。

上述杆状病毒组II核多角体病毒（group II NPV）中表达组I核多角体病毒（group I NPV）囊膜糖蛋白gp64基因的序列表在文章末尾。该序列表摘自NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1403961，Gene ID为：1403961）。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种表达gp64基因的新型基因工程重组病毒的构建方法，该方法操作简单，所构建的重组病毒具有生物安全性，其在农业的害虫防治方面具有广泛的应用前景。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的表达gp64基因的新型基因工程重组病毒是在组II核多角体病毒的基因组中表达AcMNPV GP64，其中AcMNPV是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒Autographa californica multiplenucleopolyhedrovirus的英文缩写，GP64是AcMNPV的囊膜糖蛋白。

本发明通过对野生型棉铃虫核多角体病毒Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus, 简称为HearNPV进行基因工程遗传改良后得到。具体改良方法是：在HearNPV bacmid HaBacHz8的多角体蛋白基因（polh）位点，插入：由AcMNPV p10基因启动子pP10及冷杉毒蛾核多角体病毒Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus，简称为OpMNPV的囊膜糖蛋白基因启动子pOp166共同启动的AcMNPV的gp64基因，以及由AcMNPV 多角体蛋白基因启动子pAcPolh和HearNPV多角体蛋白基因启动子pHaPolh共同启动的HearNPV多角体蛋白基因，由此得到重组病毒。

重组病毒所表达的外源基因为AcMNPV的囊膜糖蛋白基因gp64以及与AcMNPV GP64氨基酸一致性达到75%以上的同源基因，或者基因突变修饰的gp64衍生基因。

本发明提供的上述AcMNPV GP64，其在改良基因组不含有gp64的杆状病毒的杀虫活性方面的用途。

本发明提供的表达gp64基因的新型基因工程重组病毒的构建方法，其包括以下步骤：