[发明专利]甘蔗锈病检测用引物及其检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种甘蔗锈病检测用引物及其检测方法。 

背景技术：

甘蔗锈病是由真菌引起的一种甘蔗病害，该病害在爪哇、加勒比海地区(古巴、牙买加等)、澳大利亚、美国、墨西哥、印度、泰国和非洲的毛里求斯等国家已普遍发生，常造成巨大的经济损失。目前，由于引种频繁、品种单一、植期多样化及不良气候的影响下，甘蔗锈病已扩散到我国的多个甘蔗主要种植区如广西、云南、福建、四川、江西及广东等地区。因此，加强甘蔗锈病的早期检测，及时割除发病严重的病叶，对减少该病的扩散传播具有重要的意义。 

长期以来，甘蔗锈病的检测主要依赖田间症状观察和室内显微镜或电镜观察予以证实，这些检测方法不仅耗时费工，而且其结果的准确性和可信度也在很大程度上取决于研究人员的技术水平和经验，难以满足快速、高通量诊断检测的实际需求。因此，有必要利用现代生物技术，研发简单易行、灵敏准确的甘蔗锈病快速诊断和检测技术。 

本发明根据甘蔗锈病基因组序列，设计用于PCR检测的特异性引物，通过对反应体系和反应的退火温度的优化，建立了甘蔗锈病PCR检测方法，反应结束后即可根据特异性扩增片段的位置判定样品中是否为甘蔗锈病。 

发明内容：

本发明的目的在于提供用于甘蔗锈病PCR检测的引物序列及其检测方法。 

本发明通过分析已报道的甘蔗锈病基因组序列，设计引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表PM1&PM2所示。 

本发明还进一步给出了应用上述引物的PCR检测方法，该方法以样品总DNA为模板，进行PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增的593bp DNA片段判定结果。 

PCR扩增过程如下： 

在PCR管里加入：2×Taq PCR MasterMix 6.0ul，PM1(20umol/L)1.0ul，PM2(20umol/l)1.0ul，DNA模板1.0ul，灭菌ddH₂O 16ul，加完后短速离心8～10 秒后放进PCR仪，94℃预变性5min；94℃变性1min，53℃退火50s，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸5min，4℃保存。 

本发明根据甘蔗锈病基因组序列设计引物，用于甘蔗锈病的PCR检测，本发明的检测方法，引物特异性好，检测方法快速、准确、灵敏、可用于大量甘蔗样品的检测，有效克服了田间症状观察、室内显微镜或电镜观察等现有检测方法的缺点 

附图说明

图1是甘蔗锈病PCR方法特异性检测结果。1-2为甘蔗锈病的检测结果，3为甘蔗梢腐病的检测结果，4为甘蔗黑穗病的检测结果，5为健康甘蔗叶片的检测结果。 

图2是甘蔗锈病PCR检测方法的灵敏度结果。1-6的稀释梯度依次为：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5和10^-6。 

具体实施方式

下面实施例子用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。 

实施例1 引物的设计和合成 

根据GenBank数据库中已报道的甘蔗锈病基因组序列(序列登录号JN035303)设计了扩增甘蔗锈病的特异性引物PM1/PM2，扩增的目的片段大小为593bp，引物序列如下： 

PM1：5’-ATCATCTGTGGGTCAAAC-3’ 

PM2：5’-AATAAAGCCAGAGTAAGC-3’ 

实施例2甘蔗叶组织总DNA抽提： 

(1)称取0.5g具有明显甘蔗锈病症状的叶片放入研钵中，加适量液氮研磨至粉状后转至2ml离心管中； 

(2)在装有研磨物的离心管中加入600ul 65℃预热的CTAB抽提液，倒置混匀后放入65℃恒温浴锅中温育2hr，中间每隔20min颠倒离心管数次； 

(3)取出装有研磨物和CTAB抽提液的离心管置-20℃冷却2min； 

(4)加入600ul氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混匀，12000rpm/min离心10min； 

(5)取上清液加入2/3体积(340ul)的异丙醇，轻轻混匀；-20℃放置过夜； 

(6)室温下12000rpm/min离心10min； 

(7)弃上清，沉淀用70％乙醇和无水乙醇洗涤2次。