[发明专利]人源凝血因子Ⅺ催化结构域的表达、纯化及结晶

权利要求书

1.人凝血因子XI催化结构域突变体的表达方法，其特征在于：本突变体在巴斯德毕氏酵母体系中表达，并且包含如下步骤：

(1)以肝库为模板，用PCR法从肝库扩增出FXI催化结构域，正向引物S(5‘-3’)：CCGCTCGAGAAAAGAATCGTTGGAGGAACTGC；反向引物AS(5‘-3’)：ACGCGTCGACTCACACTGCTTGAGTTTTCTCCA，引物分别含Xho I和Sal I位点(用下划线标注)，用Xho I和Sal I双酶切FXI催化结构域片段和载体pPICZ_αA；将处理好的片段和载体用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化感受态Top10F′菌，用含有Zeocin抗性的平板筛选阳性克隆，DNA测序鉴定；采用重叠延伸PCR的方法对FXI催化结构域基因的432和473位点进行定点突变，第一轮PCR：以构建好含有FXI催化结构域基因的质粒为模板，分别用正向引物P1 S：ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC  和反向引物P1 AS：TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA进行第一轮PCR，PCR产物用DNA胶回收试剂盒回收纯化；第二轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P2 S：GGCATTTTACAACAATCTGAAATA和反向引物P2 AS：GAATCTGTGTATTGCACTGTGGTTT进行扩增，并回收目的DNA片段；第三轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P3 S：AAACCACAGTGCAATACACAGATTC  和反向引物P1 AS  ：TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA进行扩增，并回收目的DNA片段；第四轮PCR：以第一轮PCR回收得到的DNA片段为模板，用正向引物P1 S：ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC和第二轮PCR的产物为反向引物进行扩增，并回收目的DNA片段；第五轮PCR：以第三轮和第四轮PCR回收得到的2个DNA片段为模板，用带有Xho I和Sal I的正反引物，扩增出一条完整的带有突变位点的FXI催化结构域基因，克隆至pPICZ_αA载体，转化感受态Top10F′菌，用含有Zeocin抗性的平板筛选阳性克隆，DNA测序鉴定；以构建好的pPICZαA-rhFXI_370-607(N432Q/N473Q)质粒为模板，通过定点突变C482S，正向引物：AACGACCCATATCTCTGCCTTCC，反向引物：GGAAGGCAGAGATATGGGTCGTT构建重组质粒pPICZαA-rhFXI_370-607(N432Q/N473Q/C482S)，克隆测序；

(2)目的基因的克隆与表达：酶切去磷酸化的PCR回收产物连接到表达载体pPICZαA上，重组质粒转入大肠杆菌进行扩增，抽提质粒，测序；测序正确后，大量抽提重组质粒，重组质粒经Sac I酶切后，电转入新制的感受态细胞X-33，重组的转化子在甲醇的诱导下表达的蛋白分泌在培养液中，SDS-PAGE电泳检测培养液中含有与目的蛋白相同分子量的条带。

2.一种由权利要求1所述的方法表达的人凝血因子XI催化结构域突变体。

3.权利要求2的人凝血因子XI催化结构域突变体的纯化方法，其特征在于：甲醇诱导后的培养基首先用阳离子琼脂糖柱阶段性洗脱初步捕获蛋白，再用凝胶层析柱分离纯化，可获得纯度达98％以上蛋白。

4.权利要求2的人凝血因子XI催化结构域突变体的活性测定方法，采用S-2366发色底物检测活性，其特征在于：5nM蛋白在20mM Tris pH7.4，150mM Nacl，1％BSA反应条件下与不同浓度的S2366反应，37℃反应持续10分钟，每30秒测其A₄₀₅吸收值，并通过以下公式计算酶比活力：式中：V为反应体系体积(ml)、v为样品量(ml)、ΔA为吸光度变化。