[发明专利]一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用。

背景技术

中华蜜蜂已被列入国家畜禽遗传资源保护名录，也是辽宁省十大畜禽遗传资源保护品种之一，是我国宝贵的地方蜂种资源，饲养中蜂也已成为山区农民发家致富的有效途径。中蜂对保持我国植物生态系统具有不可替代的作用，研究表明一旦中蜂灭绝，我国将有30%的植物灭绝，目前因中蜂的减产，导致一些国家级二级保护植物濒临灭绝。近年来各地为加强中蜂业的发展，已经建立了中蜂保护区，然而，目前因中蜂囊状幼虫病的发生，已经给中蜂业造成了毁灭性的打击。1972年中蜂囊状幼虫病在广东大流行，不到半年蔓延至大半个中国，中蜂损失约百万群，严重制约了中蜂产业的发展。目前虽然有中药用于中蜂囊状幼虫病的治疗，但中药治疗主要是通过免疫调节作用，间接抗病毒，并不能直接杀死病毒，相对起效慢，尤其是对重病蜂群治愈效果较差，同时由于中药的药味会使蜜蜂不能很好的采食，甚至发生逃逸。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种卵黄抗体的制备方法、用该方法制得的卵黄抗体及其应用，可用于治疗中蜂囊状幼虫病，且疗效显著。

本发明涉及的一种卵黄抗体的制备方法，其具体步骤如下：

1、中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗的制备

将中蜂囊状幼虫病毒用BCA法检测浓度，用PH=7.4~7.8的磷酸盐缓冲液将病毒浓度稀释至0.2~0.3毫克/毫升，按稀释后的囊状幼虫病毒溶液体积的0.3~0.4%加入甲醛灭活24~48小时后，按稀释后的囊状幼虫病毒溶液体积的4~8%的加入吐温-80，做水相；司本-80与10号白油按体积比1: 9~1: 19混合，灭菌，做油相；水相与油相体积比为1:3~2:3，先将油相在8000~10000rpm搅拌，再缓慢加入水相，10000~12000rpm搅拌4~6分钟，进行无菌检验后，制得中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗，所制疫苗为油包水型；

2、卵黄抗体的制备

用制备的中蜂囊状幼虫病毒油佐剂灭活疫苗免疫产蛋鸡，首次免疫肌肉注射0.5~1毫升，之后第14~15天，第28~30天免疫加强1次，剂量加大至首次注射剂量的2~4倍，经三次免疫后，用间接ELESA法测定抗体效价，当效价达到2⁸以上时，收集鸡蛋，储于 4~8℃，以后每隔30~35天免疫一次所述产蛋鸡，以保证有效抗体效价在2⁸以上；对收集到的鸡蛋用水合法提取卵黄抗体IgY。

上述的卵黄抗体的制备方法，所述的中蜂囊状幼虫病毒通过以下步骤得到：

1、用RT-PCR检测阳性的患病幼虫与pH=7.4~7.8的磷酸盐缓冲液先混匀，每1g患病幼虫加磷酸盐缓冲液1~2ml，磨碎后的混合液加入氯仿，氯仿与所述混合液的体积比1:0.8~1:1.5，在37~40℃下匀浆8~10 min，然后800~1200 rpm离心8~10min，分别收集上清液和沉淀物；

2、取上清液，在上清液中加入与其体积比为1:0.8~1:1.5的氯仿，在37~40℃水浴中振摇8~10 min，然后800~1200 rpm离心8~10 min，分别收集上清液和沉淀物；

3、上清液继续用步骤2处理2~4次，分别收集上清液和沉淀物；

4、将所得沉淀物收集在一起，用pH=7.4~7.8的磷酸盐缓冲液溶解，每1g沉淀物加1~2ml磷酸盐缓冲液，然后800~1200 rpm离心8~10 min，取上清液，与之前经过多次处理的上清液混合，然后5000~8000 rpm离心25~30min，取上清液，10000~15000rpm离心25~30 min，再取上清液，35000~45000 rpm离心50~60 min，弃去上清液，将最后离心得到的沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，得到中蜂囊状幼虫病毒。

上述的卵黄抗体的制备方法，采用水合法提取卵黄抗体IgY时具体步骤为：

用蒸馏水将卵黄液稀释，其中卵黄抗体与蒸馏水的体积比为1:9~1:10，搅拌15~30min，用0.1mol／L的HCL调节PH= 5.0~5.2 后，放置 4~8℃冰箱 6~12 小时；然后以4~8℃，8000~10000 r／min离心25~30min, 用医用纱布过滤，取上清液，浓缩。

用上述方法制备得到的卵黄抗体。

上述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用。

上述的卵黄抗体在防治中蜂囊状幼虫病的药物中应用，其具体步骤如下：