[发明专利]纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶复合酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种液态混合菌发酵纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的方法。

背景技术

纤维质原料中纤维素、半纤维素、木质素分别占30～40％、15～30％、10～20％。纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生性天然资源。据估计，地球上纤维素中所蕴藏的能量大约相当于6400亿吨的石油所含的能量，而且纤维素的可再生性是石油等矿质能源所不可比拟的。充分利用纤维素酶处理纤维素，有可能从根本上解决人类所面临的能源与粮食问题，其深远影响是不可低估的。然而，目前约80％纤维素未被开发利用，具有极为诱人的前景。

纤维素酶的生产和其它酶制剂一样，主要有固体发酵和液体深层发酵两种，国内外在这方面做了许多有价值的工作。固体发酵法是以玉米等农作物秸秆为主要原料，其投资少，工艺简单，产品价格低廉，目前国内绝大部分纤维素酶生产厂家均采用该技术生产纤维素酶。但是固体发酵法存在着一定的缺陷，以秸秆为原料的固体发酵法生产的纤维素酶自动化程度低，劳动强度大，产品质量不稳定。因此，随着液体发酵酶工艺的发展及菌种性能的提高，采用液体发酵法生产纤维酶素是必然趋势。

木聚糖在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，是半纤维素中含量最丰富的一种。木聚糖是由D-木糖主链(以β-1，4键相连)和L-阿拉伯糖分枝(a-1，2和a-1，3相连)所组成的聚合物。半纤维素木聚糖在木质组织中占总量的50％，它结合在纤维素微纤维的表面，并且相互连接，这些纤维构成了坚硬的细胞相互连接的网络。这种坚硬的网络阻碍了纤维素酶对纤维素吸附，从而影响了纤维素的降解速率。

在天然纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠3种组分的协同作用才能完成。纤维素大分子首先在C₁酶和C_x酶的作用下逐步降解成纤维二糖，而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成2个葡萄糖。由于高浓度的纤维二糖对C₁酶和C_x酶活力有强烈的抑制作用，而在低浓度时则是纤维素酶的诱导物，如果纤维素酶复合组分中缺乏纤维二糖酶组分就会严重影响纤维素的降解速率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶及其制备方法。

本发明提供的纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶的制备方法，其为将制备的绿色木霉液体种子和黑曲霉液体种子先后接入发酵培养基中发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的复合酶。

在本发明的一个实施方案中，先将绿色木霉液体种子以体积比1～5％的接种量接种后发酵3～8天后，以体积比1～5％的接种量接入黑曲酶液体种子，再共同发酵3～8天。优选的，先将绿色木霉液体种子以体积比5％的接种量接种后发酵3～8天后，以体积比3％的接种量接入黑曲酶液体种子，再共同发酵3～8天。

其中，所述的发酵培养基为液体培养基。优选的发酵培养基含有微晶纤维素20-30wt％、玉米浆5-10wt％、尿素5-10wt％、硫酸铵5-10wt％、磷酸氢二钾5-10wt％、硫酸镁5-10wt％和Tween800.1-1wt％，其余为水。

本发明中，优选的发酵条件为：pH维持在5～7，温度25～30℃，转速200～400转/min，罐压0.05～0.15Mpa，通风比(发酵液体积：气体体积)1∶0.5～1∶1.5。

其中，用于培养绿色木霉液体种子的种子培养基含有葡萄糖3-5wt％、玉米浆2-4wt％、尿素1-3wt％、硫酸铵2-4wt％、磷酸氢二钾2-4wt％，硫酸镁0.5-1wt％，其余组分为水。用于培养黑曲霉液体种子的种子培养基含有麸皮3-5wt％、尿素1-3wt％、硝酸铵1-3wt％、磷酸二氢钾1-3wt％、碳酸钙1-3wt％，其余组分为水。

本发明中，绿色木霉液体种子的制备方法如下：将绿色木霉的孢子接入液体种子培养基中，20～30℃培养48小时。黑曲霉液体种子的制备方法如下：将黑曲霉孢子接入液体种子培养基中，20～30℃培养48小时。

本发明中，所述的绿色木霉优选为绿色木霉CGMCC 3.3744，所述的黑曲霉优选为黑曲霉CGMCC 3.3150。

本发明的关键点在于所得酶系丰富，各酶之间相互协同作用，促进酶活增加。用单一绿色木霉菌种发酵所得到纤维素酶活为20IU/ml，用单一黑曲霉菌种发酵所得到木聚糖酶酶活1000IU/ml，纤维二糖酶酶活50IU/ml，采用本技术混菌发酵后增加至纤维素酶活50IU/ml，木聚糖酶酶活4000IU/ml，纤维二糖酶酶活400IU/ml。