[发明专利]DNA分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用DNA分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的方法，属于生物技术的领域。

背景技术

蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch-Ham.ex D.Don为贵州苗族人民的习用药材，对于治疗泌尿系统疾病具有显著疗效；是著名苗药“热淋清颗粒”的唯一原料药材。

头花蓼是一种药用价值很高的中草药，也是贵州具有代表性的苗药。对头花蓼及其近缘种的药用情况进行调查结果表明，目前头花蓼及其同组植物火炭母、赤胫散、德氏蓼、尼泊尔蓼在贵州运用广泛，并且都用于风湿痹痛等疾病的治疗，民间多将同科同属植物，如火炭母P.chinense L.var.chinense、赤胫散P.runcinatum Buch.-Ham.ex D.Don var.sinense Hemsl.、尼泊尔蓼P.nepalense Meisn、德氏蓼P.dielsii Leil植物混作头花蓼使用，特别是尼泊尔蓼与头花蓼原植物形态相似，多误认作头花蓼用，但实际上二者在临床使用上是有区别的，头花蓼偏重于利尿通淋，尼泊尔蓼则偏重于治疗风湿痹痛之症。但作为干燥药材收购时，彼此之间的植物形态因皱缩而不易分辨和鉴别，从而易造成药材的混淆使用。

对于头花蓼的检测，传统的鉴定方法主要依靠形态学鉴定，缺点是主观性强。近年来，以PCR为基础的DNA分子标记鉴别技术在中药材真伪鉴别中发挥了重要的辅助鉴定作用。

RAPD操作技术简便，工作效率高，DNA样品需要量少，不受环境、发育、数量性状等影响，是一种理想和有效的分子生物学技术，在中药材种属分类、亲缘鉴别、种质资源的道地性研究等方面广泛应用。但RAPD标记有反应温度低，实验结果的重复性、稳定性较低，使研究结果无法作为有效的标记保存下来。而若在RAPD研究的基础上进一步建立SCAR标记，就能有效地克服RAPD重复性不好的缺点。

SCAR(Sequence characterized amplified regions)全称为序列特异性扩增标记，是一种基于PCR技术的单基因位点多态性遗传标记，其原理是在序列未知的DNA标记(RAPD，AFLP等)基础上，通过对RAPD片段中某一目的基因的克隆和测序，设计一对互补于该RAPD片段的序列引物，再去扩增原来的模板DNA，可得到产生单位点的SCAR DNA标记。

与RAPD技术相比，SCAR技术用一对互补到专一基因组位点的长引物和严格的PCR条件，退火温度高，选用较长的寡核苷酸引物，因此可靠性高，重复性好，对反应条件不敏感，同时揭示的信息多，有利于构建高密度的遗传图谱，能为物种的鉴别提供高效、快速、准确的方法。

经对现有技术文献的检索发现，杜明凤、陈庆富于2009年发表了“贵州和四川头花蓼居群的RAPD多态性研究”(武汉植物学研究2009，27(1)：8～11)，但上述文献是针对不同产地的头花蓼作遗传多样性分析，目的是分析来源于不同地区的同一物种之间的遗传差异，立足点在头花蓼这一个植物种内，并没有针对头花蓼与其近缘种尼泊尔蓼进行SCAR标记的鉴别研究内容。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用DNA分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼药材的方法。从而克服现有技术中，头花蓼与尼泊尔蓼的药材干品不易分辨和鉴别，预防及避免“热淋清颗粒”的原料药材混淆使用的问题。

为保证“热淋清颗粒”的原料供应、解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

一种鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的引物，所述引物序列如下：

5’-GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3’

5’-TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3’。

一种利用DNA分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的方法，操作步骤如下：

1)合成特异性鉴别引物：

按序列5’-GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3’，5’-TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3’合成一对特异性鉴别引物；

2)以改良CTAB法分别提取头花蓼DNA基因、尼泊尔蓼DNA基因；

3)以步骤2)所得的头花蓼DNA基因和尼泊尔蓼DNA基因为模板，进行PCR扩增；

4)检测PCR反应结果。

步骤2)中，所述以改良CTAB法分别提取头花蓼DNA基因、尼泊尔蓼DNA基因的步骤如下：