[发明专利]用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞包括脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。

脐带间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，具有来源广泛、易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议等诸多优点。流式细胞仪分析发现脐带间充质干细胞高表达间质细胞标志(CD44、CD105)、整合素受体(CD29、CD49b、CD49c、CD51)、不表达造血系标志(CD34、CD45)白细胞抗原HLA-DR和内皮细胞标志CD31。脐带间充质干细胞在体内外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞等。目前人脐带间充质干细胞在组织工程骨、人工血管以及基因治疗等临床应用研究中已逐渐深入，并已显示出广阔的应用前景。  目前，对脐带间充质干细胞的分离培养、扩增还没有统一的标准，存在纯度低、原代培养时间长等缺点。各种类型的成纤维成体干细胞扩增一般在2～3天开始进入指数式生长，相差不大，而原代细胞由于组织来源不同，出现细胞克隆时间差异较大，所以，原代细胞传代时间是分离得到目的细胞的关键。

发明内容

本发明提供了一种用于间充质干细胞培养的试剂盒及其应用。

本发明的用于间充质干细胞培养的试剂盒包括细胞培养液A和细胞培养液B；所述细胞培养液A为含80-120ng/ml细胞因子LIF(优选为100ng/ml)与80-120ng/ml细胞因子bFGF(优选为100ng/ml)的Knockout-DMEM培养基(液体)；所述细胞培养液B为胎牛血清。

所述所述细胞培养液A和所述细胞培养液B均为无菌的。

所述细胞培养液A和所述细胞培养液B均独立包装。

本发明的试剂盒还可包括细胞洗涤液和细胞消化液；所述细胞洗涤液为生理盐水；所述细胞消化液为Collagenase II(胶原酶II)水溶液。

所述细胞消化液具体可为0.2g/100ml Collagenase II水溶液。

所述生理盐水由氯化钠和水组成，氯化钠的浓度具体可为0.9g/100ml。

所述细胞洗涤液、所述细胞培养液A、所述细胞培养液B和所述细胞消化液均为无菌的。

所述试剂盒中，所述细胞洗涤液、所述细胞培养液A、所述细胞培养液B和所述细胞消化液均独立包装。

所述间充质干细胞具体可为脐带间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞优选为离体的脐带间充质干细胞。所述间充质干细胞具体可为获自离体的哺乳动物组织的间充质干细胞，如获自离体的人脐带组织的脐带间充质干细胞。

所述试剂盒可用于间充质干细胞培养。

应用所述试剂盒时，所述细胞培养液A和所述细胞培养液B优选按照5∶1的体积比混合。

所述间充质干细胞具体可为脐带间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞优选为离体的脐带间充质干细胞。所述间充质干细胞具体可为获自离体的哺乳动物组织的间充质干细胞，如获自离体的人脐带组织的脐带间充质干细胞。

本发明的试剂盒的应用原理为：采用Collagenase II酶有效处理脐带蛋白胶质，利用细胞因子(LIF、bFGF)组合对脐带间充质干细胞的促进作用，从而确保了原代细胞分离数量和减少原代培养时间。本发明提供的试剂盒能从离体脐带中分离脐带间充质干细胞，并培养所述脐带间充质干细胞，具有细胞扩增速度快、扩增效率高的优点，且多次传代后依然保持有细胞全能性。本发明解决了脐带间充质干细胞分离的纯度、数量和原代培养时间问题，可以获得大量脐带间充质干细胞，为利用脐带间充质干细胞进行进一步实验研究提供了丰富的来源。

附图说明

图1为原代细胞培养7天后的细胞照片。

图2为传代20次后细胞的表面抗原CD29表达情况。

图3为传代20次后细胞的表面抗原CD34表达情况。