[发明专利]用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白、质粒或细胞、编码该蛋白的DNA及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白、质粒或细胞、编码该蛋白的DNA及制备方法。

背景技术

作为多种有着催化功能的蛋白的辅助因子，亚铜离子对在整个生命过程中起到很大的作用。然而过量的亚铜离子却会与其他的金属结合蛋白发生误结合，同时自由的亚铜离子也可以催化一些反应，产生反应活性很高的氧自由基。如果体内的亚铜离子不能够很好的调控，会引发一些致命的疾病，如Wilson病和Menkes卷发综合征等。因而检测体内的亚铜离子非常重要。

构造可用于体内亚铜离子检测的传感器的主要技术难点主要在以下几个方面：1、探测器必须有较好的生物相容性和低毒性；2、探测器必须比较容易进入体内；3、探测器的信噪比较高，较容易地进行检测；4、检测专一性强，不受其他金属离子的干扰。而目前已有的两类方法，化学标记法和荧光共振能量转移法(FRET)。它们在上述4个方面或多或少都有着不可弥补的缺陷。化学方法的缺点是较低的生物相容性和其潜在的毒性。所以一直没有有效的应用到体内。荧光能量共振转移的方法基于荧光蛋白和能够结合亚铜离子的蛋白域。这种传感器能够直接在细胞内表达，因而可以克服上述1和2两项技术难点，但在3和4两方面还存在不足。目前仅有的一种报道的FRET传感器，它将青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白用一段亚铜离子结合蛋白连接起来，构成一个复合蛋白质。通过两种荧光蛋白的FRET信号来表征中间段蛋白在结合亚铜离子前后的构象变化。但目前该方法的信号还是会受到锌离子的微弱干扰，并且整体上信号在结合前后的变化幅度很小(低于10％)，需要复杂的信号处理。

发明内容

本发明提供一种用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白，检测时信号变化明显，同时可减少锌离子对亚铜离子检测的干扰。

本发明还提供表达上述荧光传感器蛋白的质粒或细胞，可以用于检测亚铜离子。

本发明还提供编码上述荧光传感器蛋白的DNA及其制备方法。

所述用于检测亚铜离子的荧光传感器蛋白，在增强绿色荧光蛋白内插入对亚铜离子响应的蛋白域，得到所述荧光传感器蛋白，使得在单一时间所述荧光传感器蛋白中的荧光蛋白和亚铜离子结合蛋白只有一个能够正确折叠。

作为优选方案，在增强绿色荧光蛋白(以下简称EGFP)中的第6个和第7个beta片间的环状区域插入亚铜离子结合蛋白Amt1，得到所述荧光传感器蛋白。

所述荧光传感器蛋白的序列为：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNlgRGRPPTTCDHCKDMRKTKNVNPSGSCNCSKLEKIRQEKGITIEEDMLMSGNMDMCLCVRGEPCRCHARRKRTQKSlgYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。

编码所述荧光传感器蛋白的DNA。所述DNA的序列为：