[发明专利]在梭菌中的双交换同源重组的方法

说明书

技术领域

本发明涉及，特别是通过利用双交换同源重组的，修改梭菌细胞的核酸的方法。

背景技术

为了进行在病原体(即难辨梭状芽孢杆菌(C.difficile))中治疗靶标的探索，或者更有 效地开发有益菌株的医疗或工业性质(癌症或生物燃料生产)，能够在预定位置有效并 可复制地操纵微生物基因组的要求是有的。例如，为了去除(“敲除”)或变更内源性细 胞功能，或为了通过增加一个或多个外源性活动(“敲入”)来扩展功能，可对微生物 基因组进行特有的变更。

在基因组操纵过程中，该宿主细胞重组机制经常是关键的。实质上，只要细胞内 的两个独立的DNA分子共有共同DNA序列区域(即同源区)，其就可通过类坎贝尔机 制(Campbell-like mechanism)“重组”以形成单DNA分子。因此，被引入至靶(target) 宿主生物体的染色体外元件(例如质粒(plasmid))可“整合(integrate)”进该宿主细胞基 因组以产生“单交换整合子”。为了让单交换活动使宿主细胞基因失活，该被引入的 DNA需要包围该基因的中间部分以致该染色体外元件整合进该靶基因的中部，从而打 断该编码序列(图1A，步骤1)。值得注意的是，由于在整合之后仍然留有促进该初始 重组活动的DNA序列的同源区，所以在整合子之中的单交换在基因上是不稳定的。 因此，第二重组活动是能够发生而导致该染色体外元件被切除和该靶基因的恢复，其 本质上是该过程的逆向(图1A，步骤2)。

利用修改染色体外元件中的同源DNA序列(即敲除盒)的设计，经由同源重组来生 成基因上稳定的突变体是有可能的。如果该敲除盒被构建成对靶DNA序列进行期望 的修改(即删除、插入或变更-如图1B中的*所显示)，并之后在旁侧的DNA序列与该 靶序列的任一侧的DNA序列同源(即同源臂)，则能够发生“双交换活动”，借此两次 独立的同源重组活动发生，各同源臂发生一次(图1B)。因为整体结果是引入在染色体 外元件的已修改的等位基因实际上与存在于宿主细胞基因组中的野生型等位基因交 换，所以双交换活动的过程常被称为“等位基因的交换”。

因为重组活动发生的频率不高(常被估计为≤1×10^-6)，所以检测出其中发生过两 次独立的双交换的双交换重组体(即在图1B中)的可能性极小。因此，普遍的做法是通 过分离第一情况中的单交换整合子(图1C)，接着随后分离该双交换整合子(图1D)来以 逐步的方式生成双交换突变体。

整合后的结果，在位于所插入质粒旁侧的染色体内，即在图1中所示的例子中为 基因A B和C，存在DNA同源区域。这些复制区域之间的同源重组会导致该介入DNA 的切除。如果重组发生在存在于基因B中突变的上游DNA区域之间，那么在质粒切 除之后仍会保留在该染色体中的基因B的拷贝就是原始的野生型基因(图1D中的切除 活动2)。然而，如果重组发生在基因B中突变的下游区域和该复制区域之间，那么在 质粒切除之后仍会保留在该染色体中的基因B的拷贝就是该突变基因(图1D中的切除 活动1)。

虽然重组活动发生的频率是低的，但是只要该整合带有生长优势，单交换整合子 就能够优先于野生型非整合细胞被选择。在最极端的情况下，如果该质粒复制子(Rep) 是有缺陷的(即完全无功能性的)，那么当将抗生素抗性编码到该质粒上时，能产生抗 生素抗性细胞的唯一方法是该质粒是否整合到该宿主细胞基因组中。类似地，如果该 Rep区域是有缺陷的(即有功能，但不如宿主细胞染色体复制子)，那么质粒复制在抗生 素存在的情况下会是在生长速度方面的限制因素。因此，该质粒整合到该宿主细胞基 因组中的细胞在抗生素存在的情况下会占有生长优势。于是，只要所用的质粒复制子 的效率适当地不如该宿主细胞染色体复制子，就能在合适的抗生素的选择下选择单交 换整合子。

生成单交换整合子后，在能否检测出导致质粒切除的少见的第二重组活动方面出 现了实际的问题。在图1D中所示的方案中，这种活动是不可选择的。因此，必须通 过适当的筛选来检测出这些活动。发生频率的不高使这过分费时。

绕过这个问题的一个方法是使用负性或反向筛选标记。可把这种标记连同抗生素 抗性标记包括在质粒骨架上(图2)。因此，由于该质粒通过单交换重组而整合，该标记 会被纳入染色体内。