[发明专利]在梭菌中的双交换同源重组的方法

权利要求书

1.一种在宿主梭菌细胞中双交换同源重组的方法，包含：

供体DNA分子和该宿主细胞的DNA之间的第一同源重组活动，从而在该宿 主细胞中形成该第一重组活动的产物，其中该供体DNA分子包含codA基因和至 少两个同源臂；以及

在该第一同源重组活动的产物内的第二重组活动，借以在宿主细胞中形成可 通过该codA基因的丢失而可选择的该第二同源重组活动的产物。

2.如权利要求1所述的方法，其中该宿主细胞的DNA包含该宿主细胞的染色体 或质粒。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该供体DNA分子进一步包含可 选择的等位基因。

4.如任一前述权利要求所述的方法，其中该codA基因是负性筛选标记。

5.如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中该codA基因是正性筛选 标记。

6.如任一前述权利要求所述的方法，其中该供体DNA分子在该宿主细胞中不被 有效地复制。

7.如任一前述权利要求中所述的方法，进一步包含选择该第一同源重组活动的产 物的步骤。

8.如任一前述权利要求中所述的方法，进一步包含选择该第二同源重组活动的产 物的步骤。

9.如任一前述权利要求所述的方法，其中该供体DNA分子进一步包含在该第一 同源重组活动中被引入至该宿主DNA的替代的等位基因。

10.如权利要求9所述的方法，其中该替代的等位基因在该第二同源重组活动之 后被保留在该宿主DNA中。

11.如任一前述权利要求所述的方法，其中该供体DNA分子包含至少两个同源 臂。

12.如任一前述权利要求所述的方法，其中该供体DNA分子是质粒。

13.如权利要求12所述的方法，其中该质粒是非复制质粒、复制缺陷质粒或条件 质粒。

14.如任一前述权利要求所述的方法，其中该梭菌细胞是梭菌属或热厌氧杆菌属 的物种。

15.如任一前述权利要求所述的方法，其中该方法进一步包含在该第一同源重组 活动之前以供体DNA分子转化宿主梭菌细胞的步骤。

16.如任一前述权利要求所述的方法，其中该方法进一步包含通过由于该codA基 因丢失而得的表型改变来分离该宿主细胞的步骤，该宿主细胞包含该第二同源重组活 动的产物。

17.如任一前述权利要求所述的方法，其中该供体DNA分子包含多核苷酸序列， 其选自任何包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的群 组。

18.一种生成已变更的宿主细胞的方法，包含提供宿主细胞和实施任一前述权利 要求所述的方法。

19.已变更的宿主细胞，其由任一前述权利要求所述的方法得到。

20.载体，其包含该codA基因和至少两个用于转化梭菌细胞的同源臂。

21.载体，其包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO： 5中任何的序列。