[发明专利]一种运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌的方法

说明书

技术领域

一种运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌的方法，属于生物分析化学技术领域。

背景技术

病原微生物广泛分布于自然界，可以侵犯人体和动物，引起感染甚至传染病，对人类和动物健康都会构成极大危害，预防病原微生物在公共卫生学上具有重要意义。食用被病原菌污染的食品是食源性疾病的主要传播途径。人畜感染后可呈无症状带菌状态，或有临床症状的疾病，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖能力。

传统的检测细菌的方法包括了生化培养、分离鉴定，检验程序复杂繁琐、报告检验结果大致需4～7d，耗时太长，而且检测灵敏度低。所以，建立快速而准确的检测方法一直是病原微生物检验研究的核心问题。随着分子生物学的发展，以核酸为基础的聚合酶链反应方法(PCR)，已被广泛应用于病原微生物菌的检测工作。

变性高效液相色谱(DHPLC)，在非变性温度下，DNA双链不解开，由于PCR产物片段大小的不同，在柱子内停留的时间也有差异，小片段的DNA分子首先被洗脱出来，通过紫外吸收光(260nm)检测，WAVE Maker核苷酸片段分析系统专用软件包将其转换为不同的峰型，参照分子量标准，通过软件系统便可读出PCR产物的不同。

PCR-DHPLC检测方法与传统微生物检验方法以及PCR-凝胶电泳法相比，具有敏感性高、特异性强、快速、准确、结果分析简单，对待样品要求不高，可进行大通量检测等优点。

病原微生物常见的有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等。

发明内容

本发明的目的是提供一种运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌的方法，灵敏度高，操作方便。

本发明的技术方案：一种运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌的方法，包括沙门氏菌培养，磁性纳米粒子的制备，沙门氏菌基因组DNA的提取，沙门氏菌特异性引物的选择，PCR扩增，PCR产物的DHPLC检测；工艺步骤为：

(1)沙门氏菌的培养：

按传统培养方法对沙门氏菌进行增菌培养，将沙门氏菌菌株一环接种于10mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC增菌液)，于36℃培养10h；

(2)磁性纳米粒子的制备：

制备羧基修饰的磁性纳米粒子，用于吸附病原微生物基因组DNA；

①取0.65g FeCl₃，0.4g柠檬酸三钠，和20mL乙二醇，搅拌反应10min；

②取1.2g醋酸钠加入步骤①所得溶液中，搅拌反应20min；

③将步骤②所得溶液在230℃下搅拌反应10h；

④向步骤③所得溶液中加入20mL无水乙醇，超声10min，6000rpm离心10min，去上清；

⑤向步骤④所得沉淀中加入20mL去离子水，超声10min，6000rpm离心10min，去上清；

⑥向步骤⑤所得沉淀中加入5mL去离子水，得到粒径为350nm的磁性纳米粒子，备用。

(3)沙门氏菌基因组DNA的提取：

①取(1)中增菌液1mL，10000rpm离心5min，去除上清；

②将步骤①所得沉淀用1mL TE缓冲液溶解，加入100μL 10％十二烷基磺酸钠SDS；

所用TE缓冲液组成为：含50mM Tris-HCl和10mM EDTA的溶液，pH8.0；

③向步骤②所得溶液中加入20μL制备的磁性纳米粒子；

④向步骤③所得溶液中加入370μL质量浓度30％PEG 6000-6mol/L NaCl混合液，室温反应15min；

⑤将步骤④所得溶液放入磁力架中，去除上清；

⑥向步骤⑤所得磁性纳米粒子中加入1mL质量浓度70％乙醇；

⑦将步骤⑥所得溶液放入磁力架中，去除上清；

⑧向步骤⑦所得磁性纳米粒子中加入100μL TE缓冲液溶解，65℃反应10min，此时所用TE缓冲液组成为：含10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8.0；

⑨将步骤⑧所得溶液放入磁力架中，取上清，即为沙门氏菌基因组DNA。

(4)设计沙门氏菌特异性引物；

根据Gene Bank中已发表的沙门氏菌hil A基因，基因序列号U6923823，利用Primer 5.0软件设计一对2条引物。

上游引物S1为：5’-CTG CCG CAG TGT TAA GGA TA-3’，

下游引物S2为：5’-CTG TCG CCT TAA TCG CAT GT-3’，

长度为497bp。

(5)以步骤(3)得到的沙门氏菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增：