[发明专利]一种L-精氨酸的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种L-精氨酸的制备方法，尤其涉及一种通过基因重组技术改进大肠杆菌积累精氨酸的能力，并利用改进的大肠杆菌发酵生产L-精氨酸的方法。

背景技术

L-精氨酸是生物代谢途径中一种重要的氨基酸，也是一种工业上用途广泛的氨基酸，可用于食品及制药等行业，生产氨基酸注射液、保肝护肝剂等，有防提高人体免疫力、防治心血管疾病等作用，并有可能是治疗肿瘤的一种潜在药物成分。

L-精氨酸发酵生产所用的菌种主要有谷氨酸棒杆菌、黄色棒杆菌、钝齿棒杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌等。这些菌种一般通过筛选抗精氨酸类似物的菌种以及诱变得到，也有些使用抗其它药物的突变体或基因重组技术改造的菌株。

细菌的精氨酸生物合成途径是由L-谷氨酸开始，经过八步酶催化反应最终生成L-精氨酸。精氨酸合成途径的酶一般都是受到严格调控的，酶基因的转录会受到精氨酸或精氨酸与阻遏物复合物的阻遏，酶蛋白的催化活性也会受到精氨酸的反馈抑制。

基因工程改造菌种多采用大肠杆菌，其中一般是在重组的大肠杆菌中引入一种编码细菌精氨酸生物合成途径的酶的基因以提高某种酶的活性，或者引入经过人工突变的酶基因，其中酶与精氨酸结合的位点得到改变，使精氨酸的抑制作用减弱或消除，从而大肠杆菌积累L-精氨酸的能力得到提高。

在细菌的代谢过程中，合成途径的各步的酶通常都会受到精氨酸的不同程度的反馈抑制。在大肠杆菌中，精氨酸抑制其合成途径的关键酶是第一步的乙酰谷氨酸合成酶，它同时受精氨酸阻遏表达及活性抑制，其余各步的酶受精氨酸的抑制作用较小。

在谷氨酸棒杆菌中，精氨酸合成途径的关键酶是第二步的乙酰谷氨酸激酶，它受到精氨酸的阻遏和抑制。而在谷氨酸棒杆菌中第一步的乙酰谷氨酸合成酶和第五步的鸟氨酸乙酰转移酶实际上是由同一个酶完成的，它基本上不受阻遏也不受抑制。

在细菌中还普遍存在一个精氨酸操纵子的调节基因argR，在不同的细菌中有不同的功能，在大肠杆菌中，argR是一个负调控基因，它会抑制细胞中精氨酸的合成。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种耗时短、安全可靠、环保型、过程简单、产量高的L-精氨酸的制备方法。

本发明要解决的技术问题是通过以下技术方案实现的：

本发明通过对大肠杆菌进行基因重组改性，敲除了大肠杆菌中的argR基因，改性后的大肠杆菌能大量发酵生产L-精氨酸。所述大肠杆菌的改性方法包括如下步骤：

(1)构建含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体：

(2)将含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体转化到大肠杆菌中，筛选阳性转化子。

在上述制备方法中，所述改性大肠杆菌的培养条件优选是：在通气条件下培养16-72小时，pH值控制在6.5-7.5，温度30-37℃。

在上述制备方法中，步骤(1)具体包括如下步骤：

利用聚合酶链反应PCR的方法，以谷氨酸棒杆菌DNA为模板，扩增乙酰谷氨酸合成酶基因，PCR用的上游引物：CTACATATGGCAGAAAAAGGCATTAC(SEQ NO：1)，其中5’端加入了NdeI限制酶切位点；下游引物：CTAGGATCCTTAAGTGCTGTACGCGGAGT(SEQ NO：2)，其中5’端加入了BamHI限制酶切位点；PCR条件：94℃30秒；60℃30秒；72℃90秒；扩增30个循环，得到乙酰谷氨酸合成酶基因；

将乙酰谷氨酸合成酶基因用NdeI和BamHI双酶切，与用同样双酶切的质粒载体pET-9a连接，得到含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体，称为pET-argJ。

在上述制备方法中，步骤(2)具体包括如下步骤：

选取表达载体pET-argJ上的卡那霉素抗性基因作为选择标记，将乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因一起整合到大肠杆菌基因组中的重组单元；

PCR上游引物序列为(SEQ NO：3)：

GTCACTGGAGCGATATCATACAGAGAGAGTTCTGAACCTGAAGGCAGTTGGGTTTTTAACAGTAGTGCAAATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAG；

PCR下游引物序列为(SEQ NO：4)：

TGGCAGGCAGTAAACCATTTCCATTTTGGCATTGCGTGTACGTACAGCACCAAACTTGGTCAACATCCGCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGG；