[发明专利]一种L-精氨酸的制备方法

权利要求书

1、一种L-精氨酸的制备方法，其特征是培养经过改性的大肠杆菌发酵生产L-精氨酸，所述大肠杆菌的改性方法包括如下步骤：

(1)构建含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体：

(2)将含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体转化到大肠杆菌中，筛选阳性转化子。

2、如权利要求1所述的L-精氨酸的制备方法，其特征在于所述培养的条件是：在通气条件下培养16-72小时，pH值控制在6.5-7.5，温度30-37℃。

3、如权利要求1所述的L-精氨酸的制备方法，其特征在于步骤(1)包括如下步骤：

利用PCR的方法，以谷氨酸棒杆菌DNA为模板，扩增乙酰谷氨酸合成酶基因，PCR用的上游引物：CTACATATGGCAGAAAAAGGCATTAC，其中5’端加入了NdeI限制酶切位点；下游引物：CTAGGATCCTTAAGTGCTGTACGCGGAGT，其中5’端加入了BamHI限制酶切位点；PCR条件：94℃30秒；60℃30秒；72℃90秒；扩增30个循环，得到乙酰谷氨酸合成酶基因；

将乙酰谷氨酸合成酶基因用NdeI和BamHI双酶切，与用同样双酶切的质粒载体pET-9a连接，得到含有乙酰谷氨酸合成酶基因的表达载体，称为pET-argJ。

4、如权利要求1所述的L-精氨酸的制备方法，其特征在于步骤(2)包括如下步骤：

选取表达载体pET-argJ上的卡那霉素抗性基因作为选择标记，将乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因一起整合到大肠杆菌基因组中的重组单元；

PCR上游引物序列为：

GTCACTGGAGCGATATCATACAGAGAGAGTTCTGAACCTGAAGGCAGTTGGGTTTTTAACAGTAGTGCAAATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAG；

PCR下游引物序列为：

TGGCAGGCAGTAAACCATTTCCATTTTGGCATTGCGTGTACGTACAGCACCAAACTTGGTCAACATCCGCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGG；

以表达载体pET-argJ为模板，用以上两条序列进行PCR扩增；PCR反应条件为：94℃30秒；72℃4分钟；扩增30个循环，得到两端带有argR基因同源重组序列、包含乙酰谷氨酸合成酶基因和卡那霉素抗性基因的重组单元；

将重组单元导入到大肠杆菌感受态细胞中；

筛选重组单元插入到大肠杆菌argR基因位点的阳性转化子。