[发明专利]沉默巨噬细胞游走抑制因子表达的小干扰RNA序列

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种沉默巨噬细胞游走抑制因子表达的小干扰RNA序列。

【背景技术】

目前恶性肿瘤治疗常采用手术、化疗、放疗、生物反应调节剂治疗相结合的综合治疗，但总体疗效仍不令人满意。因此，人们在不断寻找新的治疗方法。随着新理论的确立和新技术的不断涌现，为恶性肿瘤新疗法的出现打下基础。巨噬细胞游走抑制因子(Macrophagemigration inhibitory factor，以下简称MIF)在包括胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中都高表达，MIF能促进恶性肿瘤增殖和血管生成、抑制恶性肿瘤凋亡，因而对恶性肿瘤的发生和发展起重要作用。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种沉默巨噬细胞游走抑制因子(MIF)表达的小干扰RNA序列。

本发明由两对沉默巨噬细胞游走抑制因子(MIF)表达的小干扰RNA序列所组成。

两对沉默MIF表达的小干扰RNA(siRNA)(将它们分别命名为MIF si-1和MIF si-2)的序列分别为：

MIF si-1：正义5’-ACA UCA ACU AUU ACG ACA UGA ACG CGGdTdT-3’，

反义5’-CCG CGU UCA UGU CGU AAU AGU UGA UGUdTdT-3’。

MIF si-2：正义5’-CAU CAU GCC GAU GUU CAU CGU AAA CACdTdT-3’，

反义5’-GUG UUU ACG AUG AAC AUC GGC AUG AUGdTdT-3’。

本发明具有沉默MIF表达效率高，对恶性肿瘤有抑制作用，因而对多种恶性肿瘤有潜在治疗作用。

沉默MIF表达的siRNA对胃癌细胞增殖的抑制作用研究：

1细胞培养及转染

1.1细胞培养

细胞培养箱设置为37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下，人胃癌AGS细胞在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中传代养。

1.2MIF siRNA的设计

针对人类MIF基因mRNA序列，设计MIF siRNA和阴性对照(NC)siRNA如下(siRNA寡核苷酸序列均由27碱基构成)。

MIF si-1：正义5’-ACA UCA ACU AUU ACG ACA UGA ACG CGGdTdT-3’，

反义5’-CCG CGU UCA UGU CGU AAU AGU UGA UGUdTdT-3’。

MIF si-2：正义5’-CAU CAU GCC GAU GUU CAU CGU AAA CACdTdT-3’，

反义5’-GUG UUU ACG AUG AAC AUC GGC AUG AUGdTdT-3’。

NC：正义5’-GUU GCG CCC GCG AAU GAU AUU UAU AAUdTdT-3’，

反义5’-AUU AUA AAU AUC AUU CGC GGG CGC AACdTdT-3’。

1.3细胞转染

1.3.1转染前一天，将处于对数生长期的1.5×10⁶个AGS细胞接种在6孔板上，1.5ml含10％FBS的RPMI-1640培养基培养，24h细胞密度达到30-50％。

1.3.2 200pmolMIFsi-1用无血清Opti-MEM细胞培养基稀释成终体积185ul，轻轻混匀。

1.3.3在24ul的无血清Opti-MEM细胞培养基中加入脂质体Oligofectamine^TM 6ul，轻轻混匀室温下放置5min。

1.3.4将稀释好的MIF si-1和Oligofectamine^TM试剂混合，轻轻混匀室温放置20min，以便形成复合物。

1.3.5将215ul的复合物加入800ul无血清Opti-MEM细胞培养基的6孔板中，总体积为1015ul，siRNA的终浓度为100pmol/ml，37℃，5％CO₂的培养箱内继续培养4-6h。

1.3.64-6h后吸净6孔板内旧培养液，加入2ml含10％FBS的RPMI-1640新鲜培养基，37℃，5％CO₂的培养箱，继续培养，分别于24h、48h、72h提RNA或蛋白。