[发明专利]一种富集血清中低丰度蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体涉及一种富集血清中低丰度蛋白的方法。

背景技术

人体血清中因疾病而引起的蛋白质的含量及种类变化是临床上各种病症早期诊断及评价病情、判断预后等常规检验的一个重要指标，应用现代生物技术如蛋白质组学等寻找与疾病相关的特异蛋白质变化是当前研究的热点。然而，由于血清中的蛋白质种类超过一万种之多，其中高丰度蛋白如白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原等就多达22种，占据了蛋白质总量的99％左右，从而掩盖了可能含有特异分子的低丰度蛋白质，造成其难于被检测，因此，预先有效地去除血清中高丰度蛋白质，富集低丰度蛋白，可以提高应用蛋白质组学技术寻找疾病诊断的敏感性分子标志物的可能性。

目前在科研中虽然应用许多方法选择性地去除1～2种高丰度蛋白，但这些方法普遍纯化率偏低，操作复杂。现有的商业化产品使用成本高，而且易于去除与高丰度蛋白有相互作用的低丰度蛋白，故应用性不大，如MARS纯化柱价格昂贵，需要应用成本较高的HPLC高效液相色谱技术，该纯化过程只能去除其中6种丰度最高的蛋白质，仍然留下不少高丰度的蛋白，且由于MARS纯化柱是在非变型条件下进行纯化的，在天然构象状态下能与白蛋白等蛋白结合的蛋白也会被同时去除，导致蛋白损失过多，影响实验的结果。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种重复性好、操作简单、纯化成本低，能够有效地去除血清中的高丰度蛋白并富集大量低丰度蛋白的方法。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一种富集血清中低丰度蛋白的方法，该方法是利用肝素与血清中许多高丰度蛋白质相互作用的特性，将肝素琼脂糖作为纯化柱的填料，采用本领域技术人员进行亲和层析时的常规操作进行装柱、平衡和上样，由于不同的洗脱液会收集得到不同的洗脱成分，洗脱液的选择对洗脱效果影响很大，因此本发明人对洗脱液进行了实验研究，结果发现当采用浓度为1.5mol/L的NaCl做为洗脱液时，洗脱得到的组分中含有大量富集的低丰度蛋白，而高丰度蛋白含量很低。

上述方法中，用1.5mol/L的NaCl做为洗脱液时，可采用Tris-HCl缓冲液调节NaCl溶液的pH，如洗脱液的配方可以为：10mmol/L Tris-HCl和1.5mol/L NaCl，pH 7.0。

上述方法中，采用1.5mol/L的NaCl做为洗脱液，得到的洗脱产物还可以采用蛋白G琼脂糖凝胶(Protein G sepharose)进一步去除其中的IgG。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明的方法选择肝素琼脂糖作为纯化材料，材料本身价格便宜，利用肝素与血清中许多高丰度蛋白质相互作用的特性，应用普通的亲和层析的方法便可获得低丰度血清蛋白，而且层析过程简单易行，大大降低纯化成本，且与MARS纯化柱相比，肝素琼脂糖纯化的效果更好，能得到种类更多的血清蛋白，而且肝素琼脂糖可重复利用，也节约了成本；

2.本发明的方法能够有效去除血清中高丰度蛋白，解决血清中高丰度蛋白的干扰问题，进而高效富集大量的低丰度蛋白，获得研究中所需的目的种类的低丰度蛋白，为进一步深入研究确诊疾病的高效、特异性的低丰度蛋白标识物提供了研究条件；

3.本发明的方法为应用蛋白质组学进行疾病研究，得到所需的高效、特异性的低丰度蛋白标志物提供了研究基础，利用该方法还可以制作成商品化的蛋白纯化柱，对于在应用功能蛋白质组学进行疾病诊断标志物的寻找和疾病发病机制的研究以及药物开发的机构推广具有较大意义，产业化后也能带来良好的经济效益，同时也具有良好的社会效益。

附图说明

图1为SDS-PAGE考染和银染电泳图；

其中，1为考染电泳图，2为银染电泳图，3为Marker，4为洗脱组分，5为进一步去除IgG后组分，6为IgG，7为IgG重链，8为IgG轻链；

图2为MARS column处理所得的蛋白组分的2D-PAGE电泳图；

图3为肝素亲和富集的低丰度蛋白组分的2D-PAGE电泳图；

图4为洗脱条件优化SDS-PAGE电泳图；

其中，1为Marker，2为未处理过的血清，3为清洗组分(即肝素不结合的组分)，4为洗脱液配方(1)，5为洗脱液配方(2)，6为洗脱液配方(3)，7为洗脱液配方(4)，8为洗脱液配方仅含有1.5mol/L NaCl。

具体事实方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地解释，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1肝素亲和层析