[发明专利]一种检测牛X、Y精子分离纯度的引物

说明书

技术领域

本发明涉及核苷酸扩增技术，具体涉及一种检测牛X、Y精子分离纯度的引物，该引物能够对分离的牛X、Y精子进行纯度鉴定，从而在牛繁殖过程中起到性别控制的作用。

背景技术

性别控制在生产实际中有着巨大的应用价值，借助于性别控制技术，可选择不同性别的家畜满足生产需要，X、Y精子分离是性别控制最根本的技术手段，同时X、Y精子分离的准确程度直接关系到性别控制的效果，所以快速、准确的评价体系的建立有利于分离方法的优化与提高。另外简便快捷的评价方法直接关系到性别控制的可信程度，有助于性控精液的推广，加快市场普及速度。

目前对于分离后精子纯度鉴定主要采用流式细胞仪重分析评价法、荧光原位杂交评价法(Fluorescent In Site Hybridization，FISH)。

流式细胞仪重分析评价法

流式细胞仪重分析评价法，将分离后的精子先超声断尾，仅留下精子头部，以增加精子的定向效应；然后用荧光染料Hoechst33342进行染色体染色，使染料定量地与DNA重新结合，精子以100～200个/秒的速度通过流式细胞仪进行重分析。虽然流式细胞仪重分析评价法准确，但是受到专用仪器的限制，也牺牲了很多宝贵的机时，X精子和Y精子DNA含量差别很小时，流式细胞重分析不能保证准确性，采用同一台仪器进行分离结果的评价分析，也可能造成结果的偏差，同时流式细胞仪价格昂贵，很多实验室不能够配备。

荧光原位杂交评价法(FISH评价法)

FISH是在细胞遗传学、分子遗传学和免疫学相结合的基础上发展起来的一种检测技术，其原理是利用碱基的互补性，将标记上非放射性荧光物质(如：荧光素、DAPI等)的染色体特异核酸探针与细胞核中的染色体序列杂交。荧光原位杂交评价法由于使用了染色体特异探针等，可以得到高质量的鉴定结果；同时探针稳定，荧光试剂安全。但是FISH评价法要求在短时间内制备很多样品，无形中增加了劳动量，完成整个鉴定过程需要较长时间，同时荧光试剂价格昂贵，不利于此技术的推广应用。

因此，建立一种准确、快速、经济的检测X、Y精子分离纯度的方法是非常必要的。

发明内容

本发明目的在于提供一种检测X、Y精子分离纯度的特异扩增引物。

本发明的另一个目的在于提供一种检测X、Y精子分离纯度的方法。

本发明针对牛Y染色体性别决定基因Sry序列(gi：4878004，序列报道长度为2751bp)设计了性别特异引物Y12，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1&2所示，扩增产物长度为295bp。通过对单精子DNA模板扩增，检测扩增产物，若扩增产物长度为295bp则表明该精子为Y精子。

为避免假阳性的出现，可以设置内标引物。本发明根据牛3号常染色体序列(gi：119890289，序列报道长度为83545bp)设计一对内标引物C34，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3&4所示，该引物扩增产物长度为208bp。使用两对引物进行扩增避免了单重PCR法仅扩增Y染色体特异片断而造成的假阴性实验结果的出现，提高了检测结果的准确性。

本发明采用两对引物对单个牛精子进行双重PCR扩增，在分离的X或Y精液中分别抽查大约100个单精子进行PCR扩增，具有扩增产物长度为208bp的单精子为X精子，具有扩增产物长度为295bp和208bp的单精子为Y精子，最后统计扩增结果对精子纯度做出最终评价。

本发明方法包括单精子的分离，单精子的裂解，PCR扩增，电泳检测和结果统计五个环节。具体地说，本发明采用高浓度的碱性裂解液(500mmol/L KOH，125mmol/L DTT)裂解精子，每管单精子加1μl碱性裂解液，65℃裂解10-20min，同时中和液直接加入除模板以外的总反应体系，通常采用25μL PCR反应体系，其中Taq酶0.7U，dNTP浓度为200μmol/L，引物Y12浓度为180 pmol/L，内标引物C34浓度为180pmol/L。各离子浓度分别为96mmol/L Tris-HCl、30mmol/L KCl和1.5mmol/L MgCl₂。扩增产物采用GoldViewna^TMII荧光染料(灵敏度比EB高10倍左右)染色观察。由于Y12和C34的特异性扩增片断在200-300bp，本发明同时通过改变传统PCR反应的扩增条件，而实现55分钟左右完成PCR扩增。此外，利用现有常规仪器，使用国产化试剂，本领域的一般技术人员即可实施本发明。