[发明专利]以BCIP/NBT为底物的显色蛋白芯片及其在自身抗体检测中的应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种蛋白芯片及其应用，尤其是及一种以BCIP/NBT为底物的碱性磷酸酶显色蛋白芯片及其在自身抗体检测中的应用；属生物芯片和诊断试剂等技术领域。

(二)背景技术

自身免疫性疾病(AID)可累及多器官、多系统，对患者造成的危害极大。近年来，AID的发病率呈明显上升，约占世界总人口的3％～5％，我国患者约超过12000万。自身抗体的出现是AID最重要的特征，自身抗体的检测不仅对AID的早期诊断具有重要作用，而且在疾病分型、判断预后和治疗效果监测等多方面具有重要的意义。

目前临床上开展的自身抗体检测方法主要有间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法、免疫斑点法、免疫沉淀法等，其中多数检测方法仍以手工操作为主，检测程序较复杂，且多数检测方法不能同时检测多种自身抗体，检测结果受到检测方法、试剂、仪器及实验人员的经验等诸多因素的影响；因此，临床迫切需要一种操作简便，快速可靠，能同时检测多种自身抗体的新方法。

蛋白芯片具有的高通量、平行检测、自动化等优点，为简便、快速、同时检测多种自身抗体的解决带来了希望。目前国外Zeus公司等已经构建了包括10种自身抗原的蛋白芯片，且在自身免疫疾病中的检测中结果与传统方法的结果相似，国内也有相关方面的研究，但是蛋白芯片的检测均是采用荧光检测的方法。该方法虽然灵敏度好，但需要专用的扫描仪，对于基层的检验单位却难以全面实现，使应用受到了限制。

NBT/BCIP显色方法是一种常用的、稳定的检测系统，底物反应产物呈蓝色或紫色，既可定性又可定量，作为终点检测系统广泛的应用在免疫组织化学、原位杂交、Western

blot等检测中，在实验室和临床上应用广泛。然而，经检索NBT/BCIP显色方法在蛋白芯片中的应用至今国内外还没有相关的报道，因此，有必要将这种常用的检测方法和新的蛋白芯片技术体系结合，开发更适用于不同级别临床检测需要的简便、快速、同时检测多种抗体或抗原的蛋白芯片。

(三)发明内容：

针对现有技术的不足和临床诊断的实际需要，本发明要解决的问题是提供一种以BCIP/NBT为底物的显色蛋白芯片及其在自身抗体检测中的应用。

本发明所述以BCIP/NBT为底物的显色蛋白芯片，由基片和阵列涂布于其上的12种抗原以及阴性对照、阳性对照、空白对照制成，其特征在于：所述基片是APES修饰的玻片；所述12种抗原的种类及其点样浓度为ANA：520μg/ml，Ro-60/SSa：465μg/ml，La/SSb：530μg/ml，Jo-1：530μg/ml，Scl-70：525μg/ml，Sm：520μg/ml，Ro-52/SSa：615μg/ml，RF：340μg/ml，CCP：465μg/ml，ulRNP：410μg/ml，CENP-B：490μg/ml，dsDNA：580μg/ml；所述阴性对照为5μg/ml Human IgG；所述阳性对照为250μg/mlHuman IgG；所述空白对照为含0.1％Tween20的TBST；所述阵列布局如图1所示。

本发明所述以BCIP/NBT为底物的显色蛋白芯片在自身抗体检测中的应用。

其中：所述芯片应用方法是以BCIP/NBT为底物的碱性磷酸酶显色法作为蛋白芯片的终点检测信号。

进一步的：所述芯片应用方法是将制备好的蛋白芯片经37℃温育1h、37℃封闭30min、37℃与血清反应30min、37℃与碱性磷酸酶标记的二抗反应30min、BCIP/NBT显色20～30min，用扫描仪扫描图像，Totallab软件进行灰度分析、以同一芯片相应区域的阴性、阳性对照的灰度值作为阴性和阳性的Cutoff值对结果判读。

其中：所述扫描仪优选采用UMAX PowerLookIII扫描仪。

本发明的显色反应蛋白芯片能同时检测多种自身免疫性抗体，包括定性和定量检测，极适用于基层的临床检测应用。应用本发明所述的显色反应蛋白芯片技术体系能进一步研究开发包括检测其他抗体、抗原及其他蛋白的蛋白芯片及相应的应用。

试验结果显示：本发明的显色蛋白芯片检测结果与临床检测结果无显著性差异，两者具有较高的符合率。说明采用以BCIP/NBT为底物的碱性磷酸酶显色法作为终点信号的检测是可行的。建立的显色反应蛋白芯片技术体系与现有的蛋白芯片技术相比，具有检测成本低、易于向基层推广等优点，且该显色蛋白芯片具有较高的敏感性和特异性，是一种具有广泛应用前景的技术体系。适用于临床检测，卫生监督，海关检疫及科研等广泛的领域。

(四)附图说明

图1为本发明的蛋白芯片阵列分布图，