[发明专利]一种检测土壤酸性磷酸单酯酶活性的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及土壤中磷酸单酯酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中磷酸单酯酶活性的分析方法。

背景技术

土壤中的磷酸单酯酶能将在土壤磷代谢过程中形成的有机磷酯水解成正磷酸盐，参与有机磷的脱磷过程，成为可被微生物和作物利用的有效态。在pH4-9的土壤中均有磷酸单酯酶，多以积累态存在。

磷酸单酯酶可水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量，来估算磷酸单酯酶的活性。酸性和碱性磷酸酶的活性可以通过控制反应的pH值来分别测定。

因此，土壤中磷酸单酯酶活性的强弱影响到土壤磷代谢过程中磷素损失的大小，间接影响磷肥的利用效率。土壤磷酸单酯酶对土壤磷素的有效性具有重要作用，可以表征土壤磷酸转化方向和强度。土壤中磷酸单酯酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地等的强烈影响，同时也受农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中磷酸单酯酶活性的检验具有重要的意义。目前有关磷酸单酯酶活性的测定虽然已经形成一个相对可靠的方法，但仍然具有一定的缺陷，造成不同土壤类型测定的差异性，以及不同培养批次的差异性和不确定性，难以定性比较和定量研究土壤中磷酸单酯酶活性，降低了实验效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种土壤中磷酸单酯酶活性的检测方法。在借鉴其它酶测定方法原理的基础上，该方法根据磷酸单酯酶的特性，对其测定步骤和显色方法进行改进。该方法减少了试验步骤的不稳定性，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种检测土壤中酸性磷酸单酯酶活性的分析方法，

1)分别称取1-2g鲜土样品2n份分别置入2n个50mL三角瓶中，n≥3，分成二组，每组n个，向二组2n个三角瓶中加入0.2-0.4ml分析纯甲苯和4-8ml pH 6.45-6.55缓冲溶液试剂，向第一组n个三角瓶中加入1-2mL 25-50m moL·L^-1的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，以第二组n个三角瓶中作为样本对照，混匀，盖好瓶塞，放在36.5-37.5℃恒温培养箱中恒温培养1-2h；

2)培养结束后，向所有三角瓶中加入4-8mL 0.09-0.11moL·L^-1 pH11.5-12.5的碱性三羟基氨基甲烷溶液和1-2mL 0.25-0.5moL·L^-1氯化钙溶液，向样本对照组n个三角瓶中添加1-2mL 25-50m moL·L^-1的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，混匀，过滤；

试验中加入的碱性缓冲液溶液是用来终止酶促反应，抑制磷酸单酯到磷酸的反应，且不会产生强碱对土壤有机质的分解作用而对产物测定产生颜色干扰，同时避免在一定时间内产生沉淀而影响测定。

3)用分光光度法于410nm处分别测定上述所得三角瓶中溶液的吸光度A；

以对硝基苯酚溶液标准溶液，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和其分别用分光光度法在410nm测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；

根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中对硝基苯酚的浓度S，S＝A*b；计算样品中对硝基苯酚含量m₁；

4)计算磷酸单酯酶酶活性：

计算公式为：w＝m₁/(m₂×K)＝Sμg C₆H₅NO₃·g^-1干土·h^-1

式中：w：单位土壤单位时间内对硝基苯酚的产生量；m₁：测试溶液中对硝基苯酚的质量，样品测定吸光值折换的产物质量值；m₂：鲜土样品质量；k：水分系数，单位重量的烘干土重/鲜土重。

当步骤3)中的待测液颜色明显超过制作标准曲线最高浓度时溶液的颜色，表明其中对硝基苯酚含量过高，则用原缓冲溶液稀释5-10倍后再进行比色，若颜色还是过深(目测比对制作标准曲线最高浓度时的溶液颜色)，则重复上述稀释过程；最终再用分光光度法于410nm处测定溶液的吸光度A。