[发明专利]一种检测土壤酸性磷酸单酯酶活性的分析方法

权利要求书

1.一种检测土壤中酸性磷酸单酯酶活性的分析方法，其特征在于：

1)分别称取1-2g鲜土样品2n份分别置入2n个三角瓶中，n≥3，分成二组，每组n个，向二组2n个三角瓶中加入0.2-0.4ml分析纯甲苯和4-8ml pH6.45-6.55缓冲溶液试剂，向第一组n个三角瓶中加入1-2mL 25-50m moL·L^-1的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，以第二组n个三角瓶中作为样本对照，混匀，盖好瓶塞，放在36.5-37.5℃恒温培养中恒温培养1-2h；

2)培养结束后，向所有三角瓶中加入4-8mL 0.95-0.15moL·L^-1pH＝11.5-12.5的碱性三羟基氨基甲烷溶液和1-2mL 0.25-0.5moL·L^-1氯化钙溶液，向样本对照组n个三角瓶中添加1-2mL 25-50m moL·L^-1的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，混匀，过滤；

3)用分光光度法于410nm处分别测定上述所得三角瓶中溶液的吸光度A；

以对硝基苯酚溶液标准溶液，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和其分别用分光光度法在410nm测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；

根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中对硝基苯酚的浓度S，S＝A*b；计算样品中对硝基苯酚含量m₁；

4)计算磷酸单酯酶酶活性：

计算公式为：w＝m₁/(m₂×K)＝Sμg C₆H₅NO₃·g^-1干土·h^-1

式中：w：单位土壤单位时间内对硝基苯酚的产生量；m₁：测试溶液中对硝基苯酚的质量，样品测定吸光值折换的产物质量值；m₂：鲜土样品质量；k：水分系数，单位重量的烘干土重/鲜土重。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：当步骤3)中的待测液颜色明显超过制作标准曲线最高浓度时的颜色，表明其中对硝基苯酚含量过高，则用原缓冲溶液稀释5-10倍后再进行比色，若第一次稀释后颜色还是过深，则重复上述稀释过程；最终再用分光光度法于410nm处测定溶液的吸光度A。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述制作工作标准曲线过程为，称取1000mg对硝基苯酚溶解于1L蒸馏水中，制备1mg·mL^-1标准贮备液；吸取标准贮备液1mL，定容到100mL，此为0.01mg·mL^-1对硝基苯酚的溶液；再分别吸取该液0、1、2、3、4、5mL于试管中，用蒸馏水分别补足到相同体积5mL，加入4mL 0.1moL·L^-1碱性三羟基氨基甲烷溶液和1mL 0.5moL·L^-1氯化钙溶液，显色、混匀，过滤到比色试管中，与样品一起在410nm测定吸光度A’；此标准系列含对硝基苯酚的浓度分别为0、1、2，3、4和5μg·mL^-1，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述反应终止液为碱性THAM缓冲溶液，称取12.2g三羟基氨基甲烷于800mL蒸馏水中，用0.5mol·L^-1的NaOH调节pH至12.0，用蒸馏水定容到1000mL。