[发明专利]一种以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物降解农药残留领域，具体的说是一种以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法。

技术背景

高效氯氟氰菊酯商品名为功夫菊酯，属于拟除虫菊酯类杀虫剂中含氟的一种新型农药。由于可兼治螨类，并且用量远远低于有机磷类杀虫剂，深受农民的欢迎。

在大量推行该类农药使用的同时，也发现了其负面效应。根据我国农药毒性分级标准，功夫菊酯属中等毒性杀虫剂。对鸟类低毒，对蜜蜂、蚕、鱼类及水生生物剧毒。研究表明，功夫菊酯攻毒可以使鲤鱼红细胞的渗透脆性增加，降低红细胞膜的流动性，抑制红细胞ATP酶的活性，使红细胞形态发生改变，并使红细胞核的核膜发生溶解。对鱼类抗氧化系统损伤作用明显。虾体受其影响表现为无氧代谢加强，有氧代谢和酯类降解代谢减弱，正常的物质代谢平衡被破坏，机体所需能量减少，免疫力和抵抗外界环境的能力均明显降低；由于功夫菊酯影响，有可能诱发虾病的爆发或导致虾的大批量死亡。

一般认为功夫菊酯对哺乳类动物是安全的，但是这类化学农药的大量使用造成了环境的严重污染、生态平衡的严重破坏，从而危害了人类健康。尤其是谷物、水果、蔬菜等食品中残留的低浓度农药进入人体所造成的慢性和亚慢性毒性问题，更不可忽视。为此，相关标准也有了严格的规定。欧盟在进口茶叶农残新标准中，将功夫菊酯残留量定为1mg/kg。中华人民共和国国家标准GB18406.1-2001农产品安全质量无公害蔬菜安全要求指出，功夫菊酯在叶类菜农药中最高残留量为0.2mg/kg。

由于功夫菊酯的大范围使用，不仅使农田生态系统受损，而且对水生生物也造成了危害。因此，筛选出可以高效率降解功夫菊酯的微生物，降低作物农药残留量，减少对水生生物的影响，成为了迫切要求深入探讨与解决的问题。

从目前杀虫剂类微生物降解研究现状来看，国内外对降解菌株的分离筛选和代谢途径研究取得了一些进展，但在拟除虫菊酯类的微生物降解方面研究相对比较薄弱，分离获得能够降解拟除虫菊酯类的菌株很少。相关降解菌剂，酶制剂未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

筛选方法：

1)菌样的富集驯化：将5-10g菌样接种于含高效氯氟氰菊酯的80-100ml富集培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为25-30℃、130-200r/min摇床培养5-10天，共转接4-7次，转接量按体积百分比计每次培养液5-10％接种于含高效氯氟氰菊酯逐渐增加的80-100ml富集培养基中，待用；其中高效氯氟氰菊酯首次加入量25mg/L，而后以25-50mg/L逐渐增加，菌样首次加入富集培养基中同时加入10-20粒玻璃珠；

2)筛选：按体积百分比5-20％的接种量将步骤1)中的富集培养菌液接种于含终浓度为50-150mg/L高效氯氟氰菊酯的60-100ml基础培养基中，进行转接培养，每次转接培养条件为25-30℃下以130-200r/min摇床培养5-10天，共转接4-7次，得到以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源的混合菌液，待用；

3)分离纯化：将筛选所得的以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源的混合菌液稀释10⁵-10⁹倍，涂布于普通培养基上，于25-30℃培养2-4天，分别挑取形态不同的菌落在普通培养基上划线纯化；

4)强化：将步骤3)中分离纯化好的单一菌株划线到含终浓度为50-150mg/L的高效氯氟氰菊酯的基础培养基平板上，在25-30℃下培养3-5天，得到以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株。

所述富集培养基为蛋白胨8-10g，NaCl 0.8-1.0g，KH₂PO₄ 0.8-1.0g，葡萄糖1.0-1.2g，H₂O 1000ml，pH＝6.8-7.2；