[发明专利]一种以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法

权利要求书

1.一种以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：

1)菌样的富集驯化：将5-10g菌样接种于含高效氯氟氰菊酯的80-100ml富集培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为25-30℃、130-200r/min摇床培养5-10天，共转接4-7次，转接培养按体积百分比计每次转接量为培养液的5-10％，将其接种于含逐渐增加的高效氯氟氰菊酯的80-100ml富集培养基中，待用；其中高效氯氟氰菊酯首次加入量25mg/L，而后以25-50mg/L的增加量逐渐增加，菌样首次加入富集培养基中时同时加入10-20粒玻璃珠；

2)筛选：按体积百分比5-20％的接种量将步骤1)中的富集培养菌液接种于含终浓度为50-150mg/L高效氯氟氰菊酯的60-100ml基础培养基中，进行转接培养，每次转接培养条件为25-30℃下以130-200r/min摇床培养5-10天，共转接4-7次，得到以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源的混合菌液，待用；

3)分离纯化：将筛选所得的以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源的混合菌液稀释10⁵-10⁹倍，涂布于普通培养基上，于25-30℃培养2-4天，分别挑取形态不同的菌落在普通培养基上划线纯化；

4)强化：将步骤3)中分离纯化好的单一菌株划线到含终浓度为50-150mg/L的高效氯氟氰菊酯的基础培养基平板上，在25-30℃下培养3-5天，得到以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株；

所述富集培养基为蛋白胨8-10g，NaCl0.8-1.0g，KH₂PO₄ 0.8-1.0g，葡萄糖1.0-1.2g，H₂O 1000ml，pH＝6.8-7.2；

所述基础培养基为NH₄NO₃ 0.8-1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.4-0.6g，(NH₄)₂SO₄0.4-0.6g，NaCl0.4-0.6g，KH₂PO₄0.4-0.6g，K₂HPO₄1.2-1.8g，FeCl₃0.005-0.01g，H₂O 1000ml，pH＝6.8-7.2；

所述普通培养基为牛肉膏4.0-6.0g，蛋白胨8-12g，NaCl4.0-6.0g，琼脂15-20g，H₂O1000ml，pH＝7.0-7.2。

2.按权利要求1所述的以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：将得到的以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株接种在普通培养基中振荡培养至OD600＝1.0，而后按体积百分比计取5-15％的菌液，将菌液以12000-6000r/min，5-15min离心后接种到含高效氯氟氰菊酯终浓度为50-150mg/L的80-100ml基础培养基中，25-30℃，130-200r/min振荡培养3-5天，取菌液以12000-6000r/min，5-15min离心取上清液经石油醚萃取，萃取液采用278nm下紫外和/或气相色谱鉴定，以鉴定高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的降解能力。

3.按权利要求2所述的以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：所述气相色谱条件为：色谱柱：HP-5，30×0.32mm毛细管柱；柱温程序升温：150℃，保持2min，而后以6-8℃/min速度升温至250-270℃；进样口温度：200-220℃；检测器温度：250-320℃；载气：氮气，纯度≥99.999％，流速为1-10mL/min；不分流进样。

4.按权利要求1所述的以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：所述高效氯氟氰菊酯先经有机溶剂溶解，然后用0.22μm滤膜过滤，过滤后待有机溶剂挥发，加入相应培养基。

5.按权利要求4所述的以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：所述有机溶剂为丙酮、甲醇、正己烷或石油醚。

6.按权利要求1所述的以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：所述基础培养基配制时将含有磷酸根的试剂与不含磷酸根的试剂分开灭菌。