[发明专利]一种产碱杆菌的培养及用于腈水解制备羟基乙酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一株产碱杆菌及其用途，尤其是用于制备羟基乙酸的方法。

技术背景

羟基乙酸(HOCH₂COOH)是最简单的α-羟基酸，广泛地应用于日化、纺织和医药等行业，不仅可以作为家用和工业用的清洗剂，还可以    用作粘接剂、焊接剂、破乳剂和涂料的配料及合成多种农药、医药和化学助剂，市场需求量大。水解法合成羟基乙酸的方法有两种：化学法和生物法。生物法中涉及腈水解的酶系主要有腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶；腈水解酶能将腈水解生成相应的羧酸和氨，具有选择性好、反应条件温和及产品纯度高等优点，明显优于化学法水解。

美国专利U.S.P.3,940,316和U.S.P6,037,155利用ArthrobaterNSSC 104，Bacillus，Bacterium，Brevibacterium，Micrococcus及Variovoraxspp.将羟基乙腈水解合成羟基乙酸。日本专利JP 61,277,649报道Rhodococcus rhodochrous ATCC 33025菌株和Gordonateme MA-1菌株能将羟基乙腈水解为羟基乙酸，其转化率接近100％。专利U.S.P.6,416,980利用Acidovorax facilis 72W及变异株的腈水解酶合成羟基乙酸，野生菌有酰胺生成，变异株转化的产物浓度可以累积达1 M。中国专利CN1772912A报道的乳酪短杆菌(Brevibacterium casei) CGMCC No.0887经过长期的诱变育种，酶活力单位可以达到10万单位/mL发酵液。这些酶法合成羟基乙酸所显示的优越性，为替代化学法展示了良好的应用前景。但是现有的腈水解酶对羟基乙腈耐受性比较差，筛选新的腈水解酶菌株成为当务之急。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种产碱杆菌及其制备羟基乙酸的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

发明人从华东理工大学校园内的土壤中，经初筛、复筛及分离纯化得到一株腈水解酶菌株，经过表型鉴定和16S rDNA鉴定，该菌株为产碱杆菌Alcaligenes sp.，编号为Alcaligenes sp.ECU0401。本发明所说的产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401是一种属于产碱杆菌属的菌种，该菌株己于2007年4月27日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.2009，已申请专利CN200710040563.3(申请号)。

筛选方法包括如下步骤：

采集了不同环境条件下400份土壤样品，利用羟基乙腈为唯一氮源进行两轮液体富集培养，筛选腈水解酶产生菌。通过反复筛选，分离得到一株高活力的腈水解酶产生菌。

本发明的菌种具有如下的微生物学特征：

1.形态特征：

(1)细胞的形态：球形

(2)细胞的大小：0.5～1.2×0.5～2.6μm；

(3)掷胞子的形成：无；

2.在各种培养基上的生长状态：

(1)牛肉浸膏明胶穿刺培养(20℃，6天)：

不液化明胶；

(2)牛肉浸膏琼脂平板培养(30℃，2天)：

菌落的形态：圆形，白色，菌落表面隆起平滑、有光泽、菌落粘稠；

菌落的大小：2～4mm；

3.生理生化特征：

(1)硝酸盐利用(28℃，5天)：利用；

(2)对氧的需求：好气；

(3)胞外类淀粉化合物产生：不产生；

(4)尿素水解：阳性；

(5)甲基红试验：阴性；

(6)碳源同化：

阳性：麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、甘油、淀粉和肌醇；

阴性：乳糖；

(7)碳源发酵：不发酵碳源；

(8)生长pH范围：4.0～9.0；

(9)生长最适宜温度：20～50℃。

根据“伯杰细菌鉴定手册”提供的鉴定方法和上述的试验结果表明，该菌种属于产碱杆菌(Alcaligenes sp.)。但又与以前报道的产碱杆菌有明显的不同，其主要不同之处在于：催化羟基乙腈具有较高的活性和转化率。

经16S rDNA鉴定，确认该菌株为产碱杆菌菌(Alcaligenes sp.)，编号为Alcaligenes sp.ECU0401

本发明的产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401可以用于催化羟基乙腈生产羟基乙酸，包括如下步骤：

1.菌株的培养