[发明专利]生产二羟基丙酮的基因工程菌,其构建方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及生产二羟基丙酮的基因工程菌，其构建方法及其用途。

背景技术

1，3-二羟基丙酮(1，3-Dihydroxyacetone，简称DHA)是最简单的酮糖，呈白色晶体，易溶于水，以及乙醇、丙酮等有机溶剂。DHA是一种重要的化工原料、医药中间体和食品添加剂，在国外已得到广泛的实际应用。1，3-二羟基丙酮衍生物是有机合成化学中一类非常重要的中间体，其用途极其广泛：可用于羟醛缩合反应制取各种手性化合物；经生物或化学法还原可得到具有光学活性的仲醇；直接用于光化学反应中的Diels-Alder加成反应制备糖类化合物或经进一步反应用于该类加成反应；与2，2-二烷氧基环丙烷衍生物作用制备内酯；用于制备一些桥环化合物进而开环得到众多有用的环状化合物。此外，以1，3-二羟基丙酮衍生物为中间体合成的一些化合物表现出一定的抗病毒活性。

微生物转化甘油生产二羟基丙酮的机理是利用微生物代谢产生的甘油脱氢酶作用，使甘油分子结构中2位C上的羟基进行脱氢反应，生成1，-二羟基丙酮。反应过程中需要附酶NAD⁺的参与，NAD⁺生成NADH。国外用微生物法转化甘油为二羟基丙酮已有很多专利和文献报道，用于生产二羟基丙酮的微生物主要是醋杆菌属(Acetobacter)(US4076589)和葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)(US5770411)，尤其是氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和弱氧化醋酸杆菌(Acebobacter Suboxydans)的报道居多，此外还有芽孢杆菌属(Bacillus)、单孢丝菌属(Micromonospora)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(US4576913)等。国内报道的微生物法生产二羟基丙酮所用的菌种为弱氧化醋酸杆菌、葡萄糖酸杆菌和氧化葡萄糖杆菌。

生物转化法生产DHA与过去化学合成法相比具有专一性强、反应条件温和、底物利用率高、转化率高、生产工艺简单和副产物少等优点。

但现有的微生物转化甘油生产二羟基丙酮中所使用的微生物均为野生菌，尚无利用基因工程菌转化甘油生产二羟基丙酮的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的可将甘油转化为二羟基丙酮的基因工程菌株，其构建方法及其用途。

本发明的思路是：通过酶催化耦合催化附酶再生法提高微生物细胞生物转化甘油生产二羟基丙酮的转化效率。酶耦合催化附酶再生方法是利用NADH脱氢酶基因ndh表达产物NADH脱氢酶使甘油生成二羟基丙酮过程中所产生的附酶NADH(还原型附酶I)脱氢生成NAD⁺(氧化型附酶I)，从而继续为甘油生成二羟基丙酮过程提供附酶NAD⁺。

本发明所用到的原料是一种广泛应用于工业生产的化学品：甘油(丙三醇)，甘油2位羟基经过微生物细胞甘油脱氢酶作用，生成酮基，得到二羟基丙酮。生物转化甘油生成二羟基丙酮的反应示意图参见图1。

本发明一方面提供了一种生产二羟基丙酮的基因工程菌株，为用重组基因工程质粒pET-gdh和pET-ndh转化的大肠杆菌。

pET-gdh即为含有编码甘油脱氢酶基因的pET重组基因工程质粒，该质粒转化表达载体后，表达蛋白具有甘油脱氢酶活性。

pET-ndh即为含有编码NADH脱氢酶基因的pET重组基因工程质粒，该质粒转化表达载体后，表达蛋白具有NADH脱氢酶活性。

优选的上述大肠杆菌选自BL21、JM109、DH5a、TOP10、HB101或BLR之一。BL21、JM109、DH5a、TOP10、HB101或BLR将两个质粒分别或共同转入后，获得基因工程菌BL21/gdh+ndh或JM109/gdh+ndh、DH5a/gdh+ndh、TOP10/gdh+ndh、HB101/gdh+ndh、BLR/gdh+ndh。

优选的，重组基因工程质粒pET-gdh含SEQ ID NO：1的核苷酸序列：

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