[发明专利]生产二羟基丙酮的基因工程菌,其构建方法及其用途

权利要求书

1.一种生产二羟基丙酮的基因工程菌株，其特征在于，该菌株为用重组基因工程质粒pET-gdh和pET-ndh转化的大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其中大肠杆菌选自BL21、JM109、DH5a、TOP10、HB101或BLR之一。

3.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，重组基因工程质粒pET-gdh含有SEQ IDNO：1的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，重组基因工程质粒pET-ndh含有SEQ IDNO：2的核苷酸序列。

5.如权利要求1一4中任一权利要求所述基因工程菌株的构建方法，包括下列步骤：

a)以克雷伯氏肺炎杆菌、大肠杆菌、志贺菌、沙门氏菌、醋杆菌或葡萄糖杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增获得编码甘油脱氢酶基因gdh，利用pET系列表达载体构建重组基因工程质粒pET-gdh；

b)以克雷伯氏肺炎杆菌或大肠杆菌、志贺菌、沙门氏菌、醋杆菌或葡萄糖杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增，获得编码NADH脱氢酶基因ndh，利用pET系列表达载体构建重组基因工程质粒pET-ndh；

c)将pET-gdh和pET-ndh分别或共同转入大肠杆菌。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌选自BL21、JM109、DH5a、TOP10、HB101或BLR之一。

7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增所用的模板为克雷伯氏肺炎杆菌基因组DNA。

8.如权利要求5或7所述的构建方法，其特征在于，其中PCR扩增编码甘油脱氢酶基因gdh时所用的引物为：

Pgdh-1：5’-CCGGAATTCATGCCGCATTTGGCACTACTC-3’

Pgdh-2：5’-CCGCTCGAGTTATTCCCACTCTTGCAGG-3’；

PCR扩增编码NADH脱氢酶基因ndh时所用的引物为：

Pndh-1：5’-CCGGAATTCATGACTACGCCATTGAAAAAGATTG-3’

Pndh-2：5’-CCCAAGCTTTTAATGCAACTTCAAACGCGGAC-3’。

9.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，重组基因工程质粒pET-gdh含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，重组基因工程质粒pET-ndh含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

10.如权利要求1-4中任一权利要求所述基因工程菌株用于生产二羟基丙酮。

11.用权利要求1-4中任一权利要求所述基因工程菌株生产二羟基丙酮的方法，包括下列步骤：

a)其出发菌为权利要求1-4中任一权利要求所述基因工程菌株；

b)种子培养：在摇瓶中进行，摇床转速为100～300转/分钟，温度为27～40℃，培养时间为9～30小时；

c)发酵培养：在发酵罐中进行，发酵罐接种量为5％～20％，培养基含甘油，搅拌桨转速为100～400转/分钟，温度为27～40℃，发酵方式可以是间歇发酵、批式流加发酵或连续发酵，间歇或批式流加发酵的时间为10～200小时；

d)分离纯化二羟基丙酮。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在发酵培养过程中向发酵罐中通空气，通气量为0.2～4vvm，发酵方式为连续发酵时先进行间歇发酵，待发酵液中菌体达到650nm下光密度为0.2～0.7时，一次或多次添加IPTG至终浓度为0.1～2.5mmol·L^-1，同时流加含甘油浓度为重量体积比40％～99％的发酵培养基，进行恒化培养，pH控制在4.5～7.5范围内。

13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，步骤c)后还包括细胞催化步骤：

1)将发酵所得大肠杆菌离心分离；

2)所得细胞重悬于Tris/HCl缓冲液中，加入CTAB至终浓度为重量体积比0.01～1％或SDS至重量体积比0.1～3％或丙酮至重量体积比0.1～5％或甲苯至重量体积比0.1～5％或氯仿至重量体积比0.1～5％，处理30～120分钟；

3)离心收集细胞，将收集到的细胞用的磷酸钠或磷酸钾缓冲液洗涤，重悬于磷酸钠或磷酸钾缓冲液中，一次或多次加入甘油至终浓度为重量体积比10～70％，将该悬浮液置于转速为50～300转/分钟，温度为27～40℃条件下2～8小时；

4)离心分离细胞，上清即为生物转化得到的二羟基丙酮溶液，重复步骤2)-4)，循环2～15次。