[发明专利]葡萄糖脱氢酶

说明书

                      技术领域

本发明涉及以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的制备以及它们在葡萄糖测定上的用途。

                      发明背景

血液葡萄糖是糖尿病的一个重要标志。在使用微生物的发酵生产中，通过测定葡萄糖水平来监测该工艺。传统的葡萄糖测定是以利用葡萄糖氧化酶(GOD)或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的酶促方法为基础的。不过，基于GOD的测定要求在测试系统中添加过氧化氢酶或过氧化物酶以便对葡萄糖氧化反应中产生的过氧化氢进行定量。G6PDH已用于分光光度法的葡萄糖测定中，其中须将辅酶NAD(P)加入反应体系中。

本发明的一个目的是提供热稳定性有所改良被修饰的水溶性PQQGDH。

                      发明内容

我们发现具高稳定性的PQQGDH是酶促葡萄糖测定中另外可选择使用的新酶。由于PQQGDH具有高的葡萄糖氧化活性，并且是无需氧作为电子受体的辅酶结合酶，所以它们可用作葡萄糖传感器的识别元件。

PQQGDH催化葡萄糖氧化产生葡糖酸内酯的反应。PQQGDH包括膜结合的酶以及水溶性的酶。膜结合PQQGDH是分子量87kDa且广泛存在于多种革兰氏阴性菌中的单肽蛋白质。已在乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的多个菌株中鉴定到水溶性PQQGDH(Biosci.Biotech.Biochem.(1995)，59(8)，1548-1555)，且它们的结构基因已被克隆，获得其氨基酸序列(Mol.Gen.Genet.(1989)，217：430-436).来源于乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH是分子量约50kDa的同型二聚体。

最近，荷兰科学家对水溶性PQQGDH进行了X-射线晶体结构分析，从而得到此酶的较高级结构(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，289，319-333(1999)，来自乙酸钙不动杆菌之脱辅基形式的可溶性醌蛋白质葡萄糖脱氢酶的晶体结构显示了一种新的内部保守序列的重复片段；A.Oubrie等，The EMBO Journal，18(19)5187-5194(1999)，可溶性醌蛋白质葡萄糖脱氢酶的结构和机制，A.Oubrie等，美国国家科学院院报(PNAS)，96(21)，11787-11791(1999)，与甲肼复合的可溶性醌蛋白质葡萄糖脱氢酶的活性位点结构；共价辅因子抑制剂复合物，A.Oubrie等)。这些文献显示，水溶性PQQGDH是含6个W-基元的β-螺旋蛋白质(图7)。

为了开发可用于临床检测或食品分析的被修饰PQQGDH，我们改良了传统的水溶性PQQGDH以增加其热稳定性，作为此项研究的结果，我们通过在水溶性PQQGDH的特定区域引入氨基酸变化而成功地获得了具有很高稳定性的酶。

因此，本发明提供了以吡咯并喹啉醌为辅酶的被修饰葡萄糖脱氢酶，其中对应于由乙酸钙不动杆菌衍生的水溶性PQQGDH(此后也称为野生型PQQGDH)的第231位丝氨酸或第209位谷氨酰胺或第210位谷氨酰胺或第420位的天冬酰胺或第421位丙氨酸被其它氨基酸替代。如此处所用，“被修饰的葡萄糖脱氢酶”指天然存在的葡萄糖脱氢酶中至少一个氨基酸残基被其它氨基酸残基替代而产生的葡萄糖脱氢酶。此处的氨基酸编号由作为第+1位的甲硫氨酸开始。