本发明提供了一种扩增青椒特异性ITS序列的引物对、青椒特异性ITS序列及其应用,属于分子生物学检测技术领域。本发明的扩增青椒特异性ITS序列的引物对包括正向引物和反向引物,其中,正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。使用本发明提供的扩增青椒特异性ITS序列的引物对能够准确鉴定青椒的根系归属,将青椒根系与常见的农作物、杂草区分开来,并有效减少土壤中常见微生物对鉴定的干扰,提高青椒根系鉴定的速率及准确度,对青椒根系研究、青椒根系DNA条形码构建、土壤残茬分析具有重要意义。