本发明公开了一种基于高通量测序构建多种血友病靶向文库的引物组合、方法及试剂盒,本发明的引物组碱基序列为SEQ ID No.1~SEQ ID No.450,覆盖了F8、F9、F11、vWF、F2、F7和SRY共7个基因全部的外显子、剪接区以及部分启动子区和内含子区,共128个目标区域、225对引物,可同时一次性检测甲型血友病、乙型血友病、丙型血友病、血管性血友病、凝血因子II缺乏症和凝血因子VII缺乏症等全部本发明可应用于血友病等先天性出血性疾病的致病位点检测、筛查和家系成员筛查及相应致病变异科学研究。