本发明涉及一种构建薤白药材指纹图谱及测定薤白指标性成分含量的方法,包括:取薤白药材制备为供试品溶液;取Macrostemonoside I、25S‑Timosaponin B II和25R‑Timosaponin B II制备为对照品溶液;将所述供试品溶液和所述对照品溶液分别注入液相色谱‑质谱联用仪,根据液相色谱‑质谱联用法,获得所述薤白药材的指纹图谱,并对上述指标性成分进行含量测定。通过本发明提供的构建薤白药材指纹图谱和含量测定的方法,全面完善了薤白的评价标准,保证了薤白药材临床使用的有效性。