本发明涉及一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法。所述试剂盒包括用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crRNA,序列如SEQ ID NO.1~3所示;或者用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crDNA,序列如SEQ ID NO.4~6所示。本发明提供的用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒可以同时区分待测样品是牛种布鲁氏杆菌菌株、羊种布鲁氏杆菌菌株和猪种布鲁氏杆菌菌株,有效解决了现有技术中布鲁氏杆菌菌株生物种分别鉴定区分的问题,为后续布鲁氏菌病的治疗提供了明确的指导且操作步骤简单,通过荧光颜色即可肉眼分辨出布鲁氏杆菌菌株生物种,判断布鲁氏菌病的感染来源,为布鲁氏菌病的净化提供全新的思路和方法。